【业务上新】第二代升级PE！这才是基因编辑应该有的水平

2022年9月1日 0条评论 3,087次阅读 1人点赞

在本文开始之前先给大家直观展示一下第二代升级PE与传统CRISPR/Cas9的区别：

图1 第二代升级PE系统能够进行12种点突变以及精准插入和删除片段，产生的副产物较少、脱靶率低。

图2 CRISPR/Cas9系统介导的双键断裂修复系统会导致各种的随机突变，从而诱发癌症等不良表型。

第二代升级PE系统在David Liu开发的PE1至PE3b基础上进行了改良升级，可进行12种碱基突变以及目标位点碱基的精准插入与删除，在植物中纯合及杂合编辑效率可达到30%以上，满足植物基因编辑的实际运用需求。

1.基因编辑时代的传奇序幕

基因是一切生命活动的源头，自从沃森和克里克提出DNA双螺旋结构开始，人类便走上了破译生命密码的漫长道路。能够对任何生物体的基因组进行任何定向改造成为生命科学的长期愿景。CRISPR/Cas9技术因其具有较高的基因切割效率和简单的设计构建方法，从多种基因编辑技术中脱颖而出，成为了生命科学领域最耀眼、最有前景的技术，在过去十年中飞速发展风靡全球。CRISPR/Cas9会对目标DNA进行双链切割，但DNA双链断裂（Double-strand DNA breaks, DSBs）会激活细胞自身的双链断裂修复机制，这个修复机制往往会引入各种意想不到的突变，如：随机的插入和缺失（indel）、倒位、拷贝数变异等。而这些意外突变往往会导致组织病变或癌症（图3）。同样，DSB引发的同源重组修复（Homology-directed repair HDR）能够对DNA进行精确编辑，但HDR依赖于外源供体DNA修复模板，通常会从DSB的末端连接修复中产生过多的插入缺失，并且导致编辑效率低下。CRISPR/Cas9还有较高的脱靶编辑比例，会对非目标的DNA区域进行编辑（Anzalone et al., 2019）。因此，开发出更好的基因编辑方法成为科学界的迫切需要。

图3 脱靶效应可能造成的问题或结果（Manghwar et al., 2020）。

2.第一代引导编辑（Prime editing，PE）系统带来革新

PE是David Liu团队基于CRISPR/Cas9系统开发的全新精确基因组编辑技术。该技术的绝妙之处在于将CRISPR/Cas9系统中的sgRNA被改造成pegRNA（Prime editing guide RNA），pegRNA不仅包含引物结合位点（Primer binding site，PBS）区域，还携带着逆转录的模板序列（rtT），可以将想要的序列编辑进基因组。同时也将天然的Cas9进行改造成nCas9（Cas9H840A），只保留了切断DNA双链其中一条链的活性，并将其与鼠白血病毒（M-MLV）逆转录酶融合（图4）（Anzalone et al., 2019）。PE的详细原理可见之前的推文：PE是如何一步步上位的。

图4 PE2示意图（Anzalone et al., 2019）。PE最大的优势在于多样的编辑类型，包括碱基的12种点突变（任意转换或颠换）以及目标位点碱基的精准插入与删除。相比于传统的HDR（Homologous Directed Recombination），PE无需DSB（Double Strand Break）即可实现编辑。因此，PE与CRISPR-Cas9相比副产物更少、效率相似或更高，是更加高效、安全的基因编辑工具。科学们不断地从酶活性、PBS、rtT序列长度或构建双pegRNA来优化PE系统，虽然编辑效率也得到了极大的提升，但将其用于植物基因编辑中依然效率低下，这些PE系统都达不到实际运用的需要，被称为第一代PE技术。

3.第二代升级PE系统诞生的风雨历程

3.1 pegRNA结构的固有缺陷

科学家们逐渐意识到了第一代PE系统中pegRNA的结构缺陷：第一，在pegRNA 的3’端，通常为10-16nt的PBS易与pegRNA 5’端的Spacer互补，从而形成分子内双链和分子间双链（图5）；第二，与受Cas9蛋白保护的sgRNA相比，pegRNA的 3’延伸很可能暴露在细胞中，更容易被外切核酸降解（Nelson et al., 2022）。pegRNA的稳定性在很大程度上影响到编辑的效率，pegRNA的稳定性越高，则编辑的效率越高。

图5 结合态pegRNA和分子内/间双链pegRNA的结构示意图（来源于陈其军团队）。

3.2 对pegRNA二级结构进行改进

MS2 RNA适配体及其结合蛋白MCP与CRISPR/Cas9系统相结合已被用于基因激活和碱基编辑。中国农业大学陈其军团队将MS2 RNA适配体运用在PE系统中，开发出了MS2PE，并证明这一策略在水稻中大大提高了PE的编辑效率。MS2PE系统是在pegRNA游离的3’端加上了MS2 RNA，改造其为MS2pegR，并将MCP与M-MLV逆转录酶（RT）融合，与Cas9H840A蛋白一同表达（图6）。通过实验测试，MS2PE在水稻原生质体中显着提高了六个靶点中四个靶点的编辑效率，在转基因水稻品系中六个靶点中五个靶点的编辑效率提高了1.2~10.1倍（Chai et al., 2021）。

图6 添加MS2 RNA适配体的PE（MS2PE）。（a）MS2PE示意图；（b）MS2pegR的二级结构；（c）MS2PE的序列结构（Chai et al., 2021）。

而西北农林科技大学王小龙团队及上海科技大学黄行许团队将20nt Csy4识别位点融合到pegRNA的3’端，该位点天然存在于I-F型CRISPR-Cas系统中，通过Csy4处理会形成一个发夹，被称为extended pegRNA（图7），在诱导Cas9介导的插入缺失方面优于原本的pegRNA（Liu et al., 2021），但也可能会导致更多随机的插入和缺失，并且Csy4的添加可能会阻碍PE系统进入细胞。

图7 Extended pegRNA的二级结构（Liu et al., 2021）。

同样，David Liu团队设计了包含结构化RNA（evopreQ₁）的工程化pegRNA（engineered pegRNA, epegRNA），保护3’延伸不被外切核酸酶降解，同时保证不形成影响编辑效率双链结构（图8）。epegRNA在HeLa、U2OS和K562细胞以及原代人成纤维细胞中将PE的编辑效率提高3到4倍，而不会增加脱靶率（Nelson et al., 2022）。

图8 （a）evopreQ₁的二级结构；（b）epegRNA结构示意图（Nelson et al., 2022）。

3.3 基于错配修复的改进

David Liu团队发现细胞对碱基错配的修复酶复合体系的活性越高，PE编辑效率就越低，因此降低细胞内的碱基错配修复体系的酶活性就有可能提高PE的编辑效率。MLH1蛋白是DNA错配修复系统中的一个重要组成酶，David Liu团队在做PE编辑的同时短暂地让细胞表达缺少了核酸内切酶活性的MLH1蛋白突变体（MLH1dn），分别在PE2和PE3的基础上得到了PE4和PE5（图9）。PE2和PE3系统详情可见之前的推文：PE是如何一步步上位的。在HEK293T细胞中，PE4的编辑效率可以达到PE2的2.7倍，PE5的编辑效率可以到达PE3的1.9倍（Chen et al., 2021）。

图9 PE4编辑系统由一个Cas9n-RT复合体、MLH1dn和pegRNA组成。PE5编辑系统由一个Cas9n-RT复合体、MLH1dn、pegRNA和niking sgRNA组成（Chen et al., 2021）。

3.4 对PE蛋白酶复合体的改进

David Liu团队在PE的基础上对酶的蛋白序列进行改进。他们对逆转录酶进行了密码子优化，在原先Cas9n的基础上增加突变以提升酶切效率，在整个酶的两端加上NLS（nuclear location signal）肽段来增加复合酶对核酸的吸附力，获得PEmax（图10）。在HeLa细胞中，PEmax相比于PE2提高了2.5倍，在HEK293T细胞中提高到了1.2倍。David Liu团队还将epegRNA与PE2到PEmax的各种方法组合在一起进行多组编辑效率测试（Chen et al., 2021）。

图10 PE2和PEmax编辑器结构示意图（Chen et al., 2021）。

4.第二代PE系统在植物基因编辑上的应用

案例一：中科院高彩霞团队去除M-MLV RT中的核糖核酸酶H结构域，并掺入具有核酸伴侣活性的病毒核衣壳蛋白，得到工程植物PE编辑器（ePPE）（图11）（Zong et al., 2022）。

图11 ePPE示意图（Zong et al., 2022）。

这种第二代PE系统ePPE与改造前的PPE相比，提高了各个内源位点的碱基替换、缺失和插入的效率，平均提高了5.8倍，同时，也没有观察到副产品或脱靶编辑的显著增加。使用ePPE生成耐受磺酰脲类和咪唑啉酮除草剂的水稻植株，编辑效率为11.3%，而使用PPE的编辑效率为2.1%（Zong et al., 2022）。

图12 ePPE在植物中的基因编辑情况。（a）PE和ePPE在四个靶位点对抗性水稻愈伤组织的编辑效率的比较；（b）使用PPE和ePPE得到的OsALS-T6 T0突变体中不同突变类型的效率（Zong et al., 2022）。

案例二：

安徽农科院魏鹏程团队对提高水稻中PE系统编辑效率的各种策略进行了测试，通过可行策略的叠加开发出enpPE2系统，这一系统采用了蛋白酶优化后的PEmax，并结合受复合启动子控制的epegRNA（pegRNA-evopreQ₁）。为了更有效地生成精确的编辑，通过用U6复合启动子代替OSU3启动子（图13）。测试结果表明，enpPE2可以在转基因植物中引入精确的突变，在T₀水稻植株中，enpPE2的编辑效率为64.58%到77.08%之间（Li et al., 2022) 。

图13 PE系统的改良组合策略（Zou et al., 2022）。

案例三：

中科院黄勇团队和王春团队在pegRNA的3’末端分别添加了两个不同的结构化 RNA motif（evopreQ₁和mpknot）以获得两个不同的epegRNA，并将它们与 nCas9-M-MLV以及niking sgRNA结合分别获得了PPE3-evopreQ₁和PPE3-mpknot 系统（图14a）。当使用PPE3-evopreQ₁系统结合高温处理时，在所有八个目标位点都获得了精确编辑的植物。此外，目标位点ALS-1和ALS-2的精确编辑效率分别达到了43.4%和60.5%（图14b）（Zou et al., 2022）。

图14 用于水稻基因组精确编辑的优化PPE3系统。（a）三个PPE3系统的结构图；（b）在四个不同目标位点，三个PPE3系统运用于转基因T0植物中的编辑效率（Zou et al., 2022）。

小远叨叨

在David Liu对PE系统优化策略的基础上，采用各种策略叠加开发出的第二代升级版PE系统可进行碱基的12种点突变（任意转换或颠换）以及目标位点碱基的精准插入与删除，在植物中纯合及杂合编辑效率可达到30%以上，满足植物基因编辑的实际运用需求。我司的第二代升级PE系统具有完善的技术体系和强大的科研团队，可对水稻和玉米进行精准编辑，欢迎广大客户垂询！

References：

Anzalone AV, et al. 2019. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576:149-157.

Chai Y, Jiang Y, Wang J, Qiao D, Zhang Y, Xin C, Zhou Y, Wang X-C, Chen Q-J. 2021. MS2 RNA aptamer enhances prime editing in rice.

Chen PJ, et al. 2021. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell 184:5635-5652 e5629.

Liu Y, Yang G, Huang S, Li X, Wang X, Li G, Chi T, Chen Y, Huang X, Wang X. 2021. Enhancing prime editing by Csy4-mediated processing of pegRNA. Cell Res 31:1134-1136.

Manghwar H, Li B, Ding X, Hussain A, Lindsey K, Zhang X, Jin S. 2020. CRISPR/Cas Systems in Genome Editing: Methodologies and Tools for sgRNA Design, Off-Target Evaluation, and Strategies to Mitigate Off-Target Effects. Adv Sci (Weinh) 7:1902312.

Nelson JW, et al. 2022. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nat Biotechnol 40:402-410.

Zong Y, et al. 2022. An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants. Nat Biotechnol.

Li J, Chen L, Liang J, Xu R, Jiang Y, Li Y, Ding J, Li M, Qin R, Wei P. 2022. Development of a highly efficient prime editor 2 system in plants. Genome Biol 23:161.

Zou J, Meng X, Liu Q, Shang M, Wang K, Li J, Yu H, Wang C. 2022. Improving the efficiency of prime editing with epegRNAs and high-temperature treatment in rice. Sci China Life Sci.

官网链接：plant.biorun.com

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