甘蓝型油菜（AACC, 2n=38）是我国最为重要的油料作物之一，而增加油菜种子产油量是当前主要研究目标之一。转录因子在植物生长发育过程中起十分重要的调控作用，解析油菜种子中转录因子相互作用网络，对于揭示油菜种子重要性状形成的分子机制和进一步的遗传育种具有重要意义。
2024年1月13日，植物学知名期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了华中科技大学栗茂腾教授课题组题为“BnSTINet: An experimentally‐based transcription factor interaction network in seeds of Brassica napus”的论文，该研究利用新型高通量蛋白互作鉴定技术mCrY2H-seq建立了油菜种子发育相关转录因子互作网络，为加快揭示油菜种子发育、物质积累等生命过程的分子机理奠定了基础。
CrY2H-seq技术是在酵母双杂交技术的基础上实现蛋白互作高通量检测的新兴技术。但该技术存在互作库构建成本高、自激活蛋白干扰以及二代测序读长短等缺点，极大限制了该技术的应用。本研究在Gateway技术基础上进行了技术改进，发明了In-Gate方法；新构建的方法使文库构建的成本降低了90%；同时，改良了CrY2H-seq技术中自激活蛋白的检测流程，大大降低了自激活蛋白对阳性互作对检测的干扰；最后，应用微纳米孔测序技术替代原有二代测序技术，大大提高了阳性互作对的检出效率。
图1：In-Gate（右）与Gateway（左）技术流程和成本比较
利用改良mCrY2H-seq技术，在甘蓝型油菜发育中的种子中构建了包含941个诱饵文库和945个猎物文库，共1886个转录因子酵母菌株的互作文库，通过对阳性互作混池DNA进行测序分析，创建了由805对阳性转录因子互作对构成的互作网络，定名为BnSTINet。将BnSTINet向学术界进行了公布，发布在油菜组学数据网站BnIR（https://yanglab.hzau.edu.cn/BnIR/TF_regulation_network）上。BnSTINet是目前在油菜中构建的首张基于酵母双杂交实验数据的转录因子互作图谱。在该互作图中，包含了多种激素信号通路之间直接或间接的crosstalk信息，为进一步揭示油菜种子内激素之间协同、拮抗的复杂调控提供线索。基于BnSTINet，发现了一个和BnaWRI1相互作用的转录因子BnaGRF6，能够显著影响种子中的油脂积累；同时。利用油菜GWAS数据，发现了BnaGRF6在油菜基因组中存在一个移码突变位点，该突变位点可用来指导以后的分子聚合育种。本文创建的转录因子互作网络将对解析未知基因功能提供了线索，更重要的是为多倍体作物重要功能基因的发掘提供新的研究策略。
图2：甘蓝型油菜种子发育相关转录因子互作网络图
本文通讯作者为华中科技大学生命科学与技术学院栗茂腾教授，已毕业尹永泰博士、贾佳硕士和贺宏升硕士为论文共同第一作者，赵卫国博士、陈康博士、郭祯怡硕士以及来自华中科技大学大学生创新创业训练计划项目小组成员也参加了相关研究工作。本研究得到国家重点研发计划（2022YFD1200400）、国家自然科学基金（32172087, 32072098）项目的资助。
