快速get玉米高效遗传转化的方法

2022年6月21日 0条评论 1,217次阅读 2人点赞
玉米（Zea mays L.）是我国种植面积最大、产量最高的粮食作物，同时也是全球重要的饲料作物和经济作物。随着转基因产业化的全球推广，基因组编辑等现代分子技术快速发展，玉米进入了生物育种的新时代。但因存在基因型依赖、转化效率不高等问题，绝大部分商业化玉米的遗传转化十分困难，这也成为了玉米生物育种的卡脖子技术。近年来，随着科学家们的不断探索，玉米遗传转化技术取得了非常大的进展，为了更好的学习这方面的知识，小远特地搜集并整理了玉米高效遗传转化体系的研究论文，接下来就和小远一起去看看科学家们是如何一步一步提高玉米遗传转化效率的吧！
BBM-WUS2
Baby boom（Bbm）和Wuschel2（Wus2）是植物干细胞发育中的关键调控因子(Boutilier et al., 2002; Zuo et al., 2002)。Bbm编码一个AP2/ERF转录因子，在维持干细胞不分化状态中发挥重要作用；Wus2编码同源异型结构域蛋白，能使周围的细胞具有干细胞特征。近年来国内外先后报道了植物干细胞发育关键基因Bbm和Wus2在提高玉米转化效率方面的应用。2016年9月6日，William Gordon-Kamm团队在The Plant Cell上发表了题为“Morphogenic Regulators Baby boom and Wuschel Improve Monocot Transformation”的研究论文，该团队在玉米中发现了两个对转化效率影响极大的基因Bbm和Wus2（图1），通过过表达Bbm和Wus2基因，在之前许多不可转化的玉米自交系中获得了较高的转化效率。例如，无法通过基因枪和根癌农杆菌转化的先锋近交PHH5G，当过表达Bbm和Wus2后，从超过40%的外植体中获得了转基因愈伤组织，其中大多数可分化出健康、茁壮的植株。此外，作者将Bbm和Wus2直接转化成熟种子的胚切片或来自各种玉米近交系幼苗的叶片外植体后也可以获得健康、茁壮的T0代转基因植株（图2）。《快速get玉米高效遗传转化的方法》图1 Bbm和Wus2瞬时表达产生的早期生长表型(Lowe et al., 2016)。（A）单独引入Ubipro:moGFP:pinII（对照），在盾片表面观察单个绿色荧光细胞。（B-D）用含有nospro:Wus2:pinII和moGFP的载体转化，荧光细胞范围似乎略有扩大。（D）来自青色滤光片组的荧光显微照片和落射荧光显微照片相互叠加。（E）用含有Ubipro:Bbm:pinII和moGFP的载体转化。观察到绿色荧光多细胞簇。（F）用含有Wus2、Bbm和moGFP的载体的转化表型。

 

《快速get玉米高效遗传转化的方法》图2 玉米成熟种子或幼苗的转化(Lowe et al., 2016)。（A-D）准备用于转化的成熟胚切片，将成熟胚从籽粒中切下来（A），然后进行平行切割以获得300-400µm厚的切片，其中可以辨别出盾片（SC）和胚轴（EA）（B），在胚轴中观察到瞬时表达（C），并且在2至3周后，可以观察到愈伤组织从该区域生长出来（D）。（E-H）准备用于转化的叶组织，从单个PHH5G幼苗（E）中取出一段叶片并切成约1mm的段，经农杆菌侵染并培养7-14天后，清楚地观察到叶表面细胞簇的分散模式（F），并且随着进一步培养，可观察到转基因愈伤在光学显微镜（G）或落射荧光显微镜（H）下的表型。（I-L）通过比较来自未转化幼苗叶片（I）和转化的（BSVpro:GUS:pinII+nospro:Wus2:pinII+Ubipro:Bbm:pinII）叶片（J）的横截面，对叶片中的异位细胞分裂模式进行早期观察。

小远叨叨
形态发生基因Bbm和Wus2的使用显著增加了玉米的转化率并降低了基因型依赖。然而，Bbm/Wus2的异位表达会影响再生植株的生长，并造成不育！针对这一问题，科学家们陆续给出了解决方案，请跟着伯小远继续往下看！

方案一
2018年4月30日，William Gordon-Kamm团队在In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant上发表了题为“Rapid genotype “independent” Zea mays L. (maize) transformation via direct somatic embryogenesis”的研究论文，为了减轻Bbm/Wus2异位表达对玉米转基因植株生长以及不育的影响，该团队利用特异性启动子PLTP（磷脂转移酶蛋白基因的启动子）和Axig1（生长素诱导启动子）分别驱动Bbm和Wus2来增强基因的组织和时间特异性表达，使得不依赖玉米基因型且不经过愈伤培养阶段的高效、快速的玉米遗传转化成为现实。PLTP启动子驱动的Bbm和Axig1启动子驱动的Wus2转化玉米幼胚后，快速形成大量的体细胞胚（图3）。这些体细胞胚可以直接被转化并长成植株而不需要经过愈伤阶段，且转化植株的生长和繁殖过程均正常。此外，经过测试，该系统适用任何的玉米自交系，转化率在9%-224%之间，优异转化事件（单拷贝且不含载体骨架）的比例在3.64%-12.5%之间。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图3 用含有Zm-Axig1 pro::Wus2和Zm-PLTP pro::Bbm的T-DNA载体对未成熟胚进行农杆菌介导的转化后，玉米体细胞胚发育的组织学形态(Lowe et al., 2018)。观察到的最早的形态变化是横向或斜向细胞分裂（A），其继续分裂变成多细胞（B），并生长成早期的球状原胚（C）。在发育的体细胞胚中，经常在同一横截面中观察到多个有丝分裂过程（D）。还观察到多个独立的体细胞胚相互靠近（E），随着体细胞胚的继续发育，可以观察到胚分生组织的发育（F-G）。

方案二
2020年9月2日，Ajith Anand团队在Frontiers in Plant Science上发表了题为“An Efficient Gene Excision System in Maize”的研究论文，该研究开发了一种使用可诱导的位点特异性重组酶（Cre）来切除形态发生基因的方法，不仅优化了Bbm/Wus2的表达模式，还能进一步提高玉米转化效率。利用可诱导的热激启动子（如Hsp17.7、Hsp26，见表1）驱动Cre表达在早期胚胎发育中切除形态发生基因，再加上组织培养条件和载体设计上的改进，这样就能得到更高的T0代转化率（29-69%）、切除率（50-97%）、优异转化体比例（4-15%），以及在3个优良玉米自交系中能够获得更低的非转基因转化体（14-17%）（表2）。通过使用Cre来切除形态发生基因的方法，获得的转化体不含形态发生基因和筛选标记，与此同时还可以提高玉米自交系转化效率。表1 使用能驱动Cre表达的热休克启动子Hsp17.7、Hsp26来优化热休克条件以进行受控基因切除(Wang et al., 2020)。《快速get玉米高效遗传转化的方法》表2 使用Hsp17.7热休克启动子调控Cre切除三个玉米自交系（HC69、PH85E和PH84Z）中的形态发生基因和标记基因的结果(Wang et al., 2020)。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

 

方案三
2022年4月20日，严建兵团队在《作物学报》杂志上，发表了题为“不依赖基因型的高效玉米遗传转化体系的建立”的研究论文，该研究报道了一种新型辅助转化技术，通过在Bbm和Wus2的超表达辅助载体中加入绿色组织特异性表达启动子驱动解淀粉芽孢杆菌Barnase基因表达的致死表达元件，并采用与基因编辑载体混合转化技术的策略进行测试（图4）。研究发现含有Bbm-Wus2表达元件的愈伤组织大部分不能分化成苗，科研人员在T0代即可快速分离获得大量不含Bbm-Wus2元件并且可以正常生长发育的优质转化苗。该技术成功提高了多个商业化玉米品种亲本自交系的遗传转化效率，可以实现不依赖玉米基因型的高效遗传转化（图5）。通过郑58、京724等材料的转化测试表明玉米优良自交系的转化效率可以达到11.5%~16.4%（表3）。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图4 辅助载体和基因敲除载体示意图(许洁婷等, 2022)。

 

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图5 混合转化后的基因型分离检测（A，C）和Waxy基因编辑情况（B）(许洁婷等, 2022)。

 

表3 四个玉米自交系中pWMDR003和基因编辑载体混合转化的转化效率(许洁婷等, 2022)。

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

小远叨叨
上述通过表达形态发生基因Bbm和Wus2来提高玉米转化效率的案例，都是在双元载体系统中进行的。而在玉米遗传转化过程中，还可以采用三元载体系统来实现高效的遗传转化，那么具体应该如何操作呢，接下来就和小远一起学习吧~
三元载体
双元载体系统的出现已经满足了大多数植物基因工程的需要并成为了植物遗传转化的主流转化系统。但对于一些顽拗型植物材料来说，使用农杆菌双元载体系统介导的遗传转化效率仍然不高甚至难以实现转化。在双元载体系统和超双元载体系统难以高效转化的情况下，引入额外的辅助质粒形成三元载体系统（图6）可以有效提高顽拗型植物的遗传转化效率。在玉米遗传转化过程中，引入额外毒力基因的三元载体系统，通过共表达琥珀碱和章鱼碱毒力基因使得顽拗型玉米的遗传转化率近乎翻倍(Anand et al., 2018)。《快速get玉米高效遗传转化的方法》图6 农杆菌载体系统的发展，来源：GOLDBIO。图中简要展示了野生型Ti质粒、双元载体、超双元载体、三元载体的质粒结构和适用场景。对质粒中毒力基因的改造可提高农杆菌侵染效率。

2018年4月23日，Ajith Anand团队在Plant Molecular Biology上发表了题为“An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation”的研究论文，该研究开发了一种带有辅助质粒“pVIR”的三元载体系统，此系统弥补了pSB1载体原有的毒力基因缺陷，并增加了毒性基因，简化了载体构建步骤。将辅助质粒与T-DNA双元载体结合起来形成的三元载体，对之前转化效率较低的玉米自交系进行遗传转化，可使转化效率显著增加（图7、表4）。此外，研究人员对辅助质粒和T-DNA载体上的复制起点进行筛选（图8），鉴定出了四种ORI-by-ORI组合，分别是pSa/pVS1、RK2/pSa、pRi/RK2和pRi/pVS1，它们会使优异玉米自交系的转化效率高达86%-103%。最后，作者在三元载体系统的辅助质粒中引入形态调节基因Bbm和Wus2后，发现可以有效提高植物遗传转化的效率并缩短转化周期。

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图7 pPHP70298改善了玉米中的瞬时和稳定T-DNA转化(Anand et al., 2018)。用双元载体pPHP45981（A）、三元载体pSB1/pPHP45981（B）和pPHP70298/pPHP45981（C）转化PH2RT未成熟胚5天后，荧光蛋白的表达情况。三元载体pSB1/pPHP45981（D）和pPHP70298/pPHP45981（E）产生的愈伤组织生长情况。

 

表4 两种不同玉米自交系HC69和PH2RT中的转化数据(Anand et al., 2018)。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图8 在玉米快速转化系统中测试的不同ORI-by-ORI的示意图(Anand et al., 2018)。（A）用于评估12种不同ORI-by-ORI的三元载体，其中包含基于pPHP79761的辅助质粒，其复制子不同。（B）以pRi（双元质粒）/pVS1（辅助质粒pPHP71539）复制子作为实验对照的三元载体设计。 
小远叨叨
近年来，科学家们在提高玉米遗传转化效率的研究中，除了不断改进载体系统外，还结合化学以及物理手段来对玉米高效遗传体系进行改良，小远通过查阅文献为大家总结了两类方法，分别是：利用Ca2+通道阻滞剂来提高农杆菌的转化率，以及基于纳米磁珠介导的玉米遗传转化方法，接下来就和小远一起看看这两类方法的具体内容吧~
钙离子通道阻滞剂
农杆菌介导的基因转移系统是植物基因工程中比较完善与有效的方法，在众多的转基因植物中有80%以上是由农杆菌介导完成转化的。当农杆菌侵染植物时，植物会发生一系列信号转导事件，包括Ca2+浓度增加，活性氧（ROS）积累，丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和Ca2+依赖蛋白激酶介导的信号级联激活等(Lamb and Dixon 1997; Boller and Felix 2009)。而Ca2+通道阻滞剂LaCl3能抑制拟南芥防御信号的远距离传输(Toyota, et al., 2018)。基于以上研究结果，逯敏慧团队提出是否可以通过抑制植物对农杆菌的先天免疫应答来提高农杆菌介导的转化率。2022年4月4日，逯敏慧团队在Plant Cell Reports上发表了题为“LaCl3 treatment improves Agrobacterium-mediated immature embryo genetic transformation frequency of maize”的研究论文。在该文中，作者将玉米自交系ND101的幼胚用不同浓度的LaCl3（Ca2+通道阻断剂）预处理后，再用农杆菌EHA105进行转化（图9）。结果表明，LaCl3预处理幼胚后可显著提高农杆菌的转化率，其中，LaCl3的预处理浓度为10mM时为最佳。LaCl3预处理不仅不会影响胚性愈伤组织的形成，还能增加阳性愈伤组织的比例（图10）。经过LaCl3处理后，再生率从13.20%增加到27.20%，是对照组的两倍以上。最后，作者用PCR鉴定了阳性T0植株并计算了转化率。结果显示，玉米的转化效率从8.40%提高到17.60%，低拷贝事件效率也从8.00%增加到15.20%（图11）。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图9 经LaCl3预处理的玉米遗传转化示意图(Liu et al., 2022)。

 

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图10 用10mM LaCl3预处理玉米未成熟胚可提高愈伤组织的阳性率(Liu et al., 2022)。（A）RFP阳性的愈伤组织在选择性培养基中培养10天，在RFP（左）和明场（右）下用荧光显微镜观察，白色星号表示不定芽。（B）RFP阳性愈伤组织的统计学分析。

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图11 用10mM LaCl3预处理玉米未成熟胚可提高玉米的转化率(Liu et al., 2022)。（A）在再生培养基中培养20天的愈伤组织的形态。（B）再生速率的统计学分析。（C）用PCR检测T0植株的阳性情况。（D）转化率的统计学分析。（E）Bar阳性的T0植株，被移植到营养土中种植。 
纳米磁珠
有效的遗传转化对于玉米转基因育种至关重要，目前科学家们已经开发了多种DNA的递送方法来产生转基因玉米植株，包括粒子轰击、农杆菌介导、聚乙二醇（PEG）介导、脂质体介导、显微注射等，这些方法主要依赖于组织培养系统、受基因型限制、可用于高效转化的玉米材料少，并且转化成本高，严重限制了玉米品种精准改良特别是基因编辑育种的效率。因此，急需一种不依赖组培体系、不受基因型限制的玉米新型高效DNA导入方法。2022年4月13日，吴忠义团队在Journal of Integrative Plant Biology上发表了题为“Efficient and genotype independent maize transformation using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles”的研究论文。该论文报道了一种基于纳米磁珠介导的不依赖基因型的玉米遗传转化方法（图12）。作者首先使用转化液在8℃条件下预处理花粉10分钟，这一处理能在保持花粉活力的前提下，大幅提高花粉萌发孔打开的效率（达到40%-55%），为纳米磁珠-DNA复合体高效进入花粉提供了保障。接着借助纳米磁珠将外源基因通过花粉萌发孔导入玉米花粉中（图13），最后，通过对玉米自交系的雄性小花进行人工授粉，成功的将外源基因转入多种玉米自交系中（图14）。该方法的建立，为大多数难以利用组织培养进行遗传转化的玉米品种提供了解决方案。《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图12 纳米磁珠介导的不依赖基因型的玉米遗传转化流程(Wang et al., 2022)。（A）用质粒DNA涂覆磁性纳米颗粒（MNPS）。（B）收集田间玉米花粉。（C）用转化缓冲液在8°C下预处理花粉10分钟。（D）花粉在8°C下转化20分钟。（E）过滤并吸干花粉，将花粉与玉米淀粉混合。（F）人工授粉。

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图13 花粉萌发孔的打开是纳米磁珠介导的外源基因成功导入花粉和幼胚的关键(Wang et al., 2022)。（A）从田间种植的玉米中收集的新鲜花粉的扫描电镜图像。（B）用转染缓冲液在8°C下预处理10分钟的玉米花粉的扫描电镜图像，图中展示的是打开状态的花粉萌发孔。（C-F）使用RFP作为报告基因，检测不同条件下花粉的转化率。（G-J）使用GUS作为报告基因，检测不同条件下玉米幼胚的转化率；（K）玉米幼胚GUS阳性百分比。

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

图14 EGFP基因在经转化花粉授粉的玉米植物中的表达(Wang et al., 2022)。（A-D）EGFP基因通过花粉转化递送到玉米自交系Jing 92中，在共聚焦显微镜下可观察到绿色荧光。（E-G）检测EGFP基因的转录本和蛋白，顶部的数字是指不同的幼苗。
小远叨叨
玉米遗传转化的效率会受农杆菌菌株、受体材料、培养基成分、筛选方式等的影响。例如，受体基因型不同，农杆菌介导的转化效率也会不同。因此，很长一段时间以来，许多基因型的玉米转化效率不佳，这也极大的限制了玉米生物育种的发展。近年来，为了开发玉米高效遗传转化体系，许多科学家们不断深入探索，相关的研究成果也陆续涌现。在本文中小远主要给大家总结了四类玉米高效遗传转化方法，希望大家通过阅读本文不仅可以对玉米高效遗传转化体系的发展有一定了解，还可以从前辈们的科研成果中得到启发。文章至此就结束啦，大家一起期待下期的推文吧，如果小伙伴们有想看的文章内容也可以留言或者私信小远哦！参考文献：

Anand A, Bass SH, Wu E, et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Mol Biol. 2018, 97(1-2): 187-200.Boutilier K, Offringa R, Sharma V K, et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. Plant Cell, 2002, 14: 1737-1749.Boller T, Felix G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Annu Rev Plant Biol. 2009, 60: 379-406.

Lamb C, Dixon RA. The oxidative burst in plant disease resistance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1997, 48: 251-275.

Lowe K, Wu E, Wang N, et al. Morphogenic Regulators Baby boom and Wuschel Improve Monocot Transformation. Plant Cell. 2016, 28(9): 1998-2015.

Lowe K, La Rota M, Hoerster G, et al. Rapid genotype “independent” Zea mays L. (maize) transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2018, 54(3): 240-252.

Liu S, Shi Y, Liu F, et al. LaCl3 Treatment Improves Agrobacterium-mediated Immature Embryo Genetic Transformation Frequency of Maize. Plant Cell Reports. 2022.

Toyota M, Spencer D, Sawai-Toyota S, et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 2018, 361: 1112-1115.

Wang N, Arling M, Hoerster G, et al. An Efficient Gene Excision System in Maize. Front Plant Sci. 2020, 11: 1298.

Wang ZP, Zhang ZB, Zheng DY, et al. Efficient and genotype independent maize transformation using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles. J Integr Plant Biol. 2022.

Zuo J, Niu Q W, Frugis G, et al. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. Plant J, 2002, 30: 349-359.

许洁婷, 刘相国, 金敏亮, 等.不依赖基因型的高效玉米遗传转化体系的建立.作物学报, 2022, 1-8.

《快速get玉米高效遗传转化的方法》

官网链接：plant.biorun.com

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