黄矮病（yellow dwarf disease）是世界上严重影响禾谷类粮食作物（小麦、大麦、燕麦等）与多种牧草产量与品质的重要病毒病害，主要由几种基因组类似、但蚜虫传播载体有差异的大麦黄矮病毒（barley yellow dwarf viruses, BYDVs）引起。虽然国内外科研人员对禾谷类黄矮病进行了60余年的研究，但对BYDV致病机理及麦类黄矮病抗性基因的认识仍然十分有限。已有研究表明全球气候变暖将加重禾谷类黄矮病的危害，因此有必要系统和深入解析BYDV致病机理，为利用生物育种技术快速创制抗黄矮病新种质与新品种提供有益基因资源。近日，河南农业大学农学院王道文、郭天财实验室联合中国农科院植保所靳怀冰博士发表了“Appropriate reduction of Importin-a gene expression enhances yellow dwarf disease resistance in common wheat”的研究论文（Plant Biotechnology Journal, doi.org/10.1111/pbi.14204）。该研究证明了宿主植物Importin-a基因在BYDV-GAV致病过程中的重要作用，通过基因组编辑技术创制了一系列Importin-a基因敲除突变体，并从中鉴定出两种黄矮病抗性显著增强、具有潜在育种应用价值的新种质。

BYDV-GAV编码的17K蛋白进入宿主植物的细胞核并在致病过程种发挥多种作用，但是17K蛋白进入细胞核的分子机制不清楚。本研究利用过表达17K蛋白的转基因株系进行免疫沉淀结合质谱分析，发现17K蛋白与核转运受体蛋白Importin-a互作（图1）。

图1：BYDV-GAV 17K蛋白与大麦Importin-a蛋白的互作分析。

通过软件预测发现了17K氨基酸序列中可能存在非典型的核定位信号序列（NLS）。在小麦原生质体中表达缺失NLS序列的17K突变体与GFP的融合蛋白（17K33del-GFP），发现17K33del-GFP不再进入细胞核中，但该NLS可促使GFP进入细胞核。此外，17K33del不能与Importin-a蛋白互作。这些结果表明该NLS序列介导17K蛋白与Importin-a蛋白互作，从而使BYDV-GAV的17K蛋白借助宿主植物的核蛋白转运系统进入细胞核（图2）。

图2：Importin-a蛋白通过与17K蛋白中NLS互作介导17K蛋白的入核。

作者利用病毒诱导基因沉默技术，在大麦中证明了Importin-a基因是17K蛋白高效进入细胞核所必需的。进一步利用基因组编辑技术，针对六倍体普通小麦的6个Importin-a基因，创制出九种缺失不同成员的突变体。通过一系列分析，发现一种三突变体（α1aaBBDD/α2AAbbdd）和另一种四突变体（α1aabbdd/α2AAbbDD）表现为BYDV-GAV抗性显著增强而又不影响小麦自身的生长发育（图3）。过多的Importin-a基因缺失（如五突变体α1aabbdd/α2Aabbdd，论文中Figure S6）显著抑制小麦生长，但较少的Importin-a基因缺失导致抗病毒能力提高不明显。因此，适当降低Importin-a基因表达对于提高普通小麦的BYDV-GAV抗性至关重要。

图3：普通小麦Importin-a基因缺失突变体对BYDV-GAV抗性的分析。

众所周知，病毒复制需要借助宿主细胞的功能蛋白，而这些蛋白通常在宿主本身的生长发育中具有重要作用。然而六倍体普通小麦含有三个亚基因组（A、B、D），大多数基因具有2 – 3个功能互补的拷贝，这为利用基因组编辑技术在普通小麦中创制合适基因缺失的突变体，进而获得病毒抗性显著增强的新种质提供了可能。但未来需要在不同环境中进一步检测α1aaBBDD/α2AAbbdd和α1aabbdd/α2AAbbDD材料对多种BYDV的抗性，用以验证其真实育种应用价值。

值得指出的是，前人已发现Importin-a蛋白参与了多种动植物病毒致病蛋白的细胞核转运过程，因此本研究的结果对于未来通过适当操作Importin-a基因而提高动植物病毒抗性具有较好的指导意义。

河南农业大学农学院博士生王利娜和张坤普研究员为论文的共同第一作者，王道文研究员、郭天财教授和中国农科院植保所靳怀冰博士为论文的共同通讯作者。中国农科院植保所王锡锋研究员和刘艳研究员参与了部分研究。该研究得到了河南省重点科技计划和神农实验室的资助。

文章来源：植物生物技术Pbj