近日，华中农业大学园艺林学学院李峰教授团队在植物学国际知名期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“Guide RNA scaffold variants enabled easy cloning of large gRNA cluster for multiplexed gene editing”的研究论文。该研究开发了一种简便高效的多基因编辑载体克隆方法，为番茄及其他作物的基因功能研究和遗传改良提供了有力的工具。
CRISPR-Cas9介导的基因编辑在基因功能研究及遗传改良方面有着十分重要的作用。利用真核生物体内tRNA的生成机制将sgRNA中的间隔序列与tRNA串联便可产生多个sgRNA，进而实现多基因的同时编辑。传统的多基因编辑载体构建方法存在构建过程复杂、阳性率低以及周期长等问题。因此，开发一种简单且高效的多基因编辑载体构建方法具有重要的意义。本研究建立了一种多基因编辑载体的克隆方法，简化了多基因编辑载体的构建过程，并在番茄中成功应用该方法实现了多基因的快速编辑。
本研究中作者对原始的sgRNA骨架序列进行了定点突变和随机突变并鉴定得到了大量的sgRNA骨架变异序列。之后利用不同的骨架变异序列和不同的tRNA通过融合PCR成功得到包含9个sgRNA的sgRNA簇。结合Goldengate克隆技术一步反应构建出表达24个sgRNA的多基因编辑载体。且与传统的仅使用Goldengate克隆方式相比，载体阳性率有很大的提高（见图1）。
将得到的含有24个sgRNA簇的多基因编辑载体在番茄内进行功能测试，结果显示，在T0代中共检测到10个靶基因发生编辑。随后对转基因株系的T1代进行检测，确认编辑位点可以稳定遗传给后代，从而验证了新的骨架变异序列及超级sgRNA簇的功能（见图2）。
最后，为了提高多基因编辑载体构建方法在不同物种中的适用性，本研究搭建了用于设计引物和指导融合过程的配套网站SupClusterWriter。并且，在网站中提供了适用于茄科、十字花科和禾本科作物的tRNA（见图3）。
图3
该研究论文第一作者为华中农业大学园艺林学学院博士生王亚奇，已毕业硕士生李晓飞、刘明磊，在站博士后周迎佳参与了本文研究。论文通讯作者为李峰教授。这项工作得到了国家自然科学基金(32272491, 91940301)和国家重点研发项目(2018YFD1000800)的资助。
文章来源：植物生物技术Pbj
