先导编辑（PE）技术利用扩展的引导编辑向导RNA（pegRNA）将由nCas9（H840）和逆转录酶（RT）组成的融合肽引导至基因组中的特定位置。这使得能够通过 RT 活性使用pegRNA的拓展部分在目标位点进行碱基变化。PE已证明其在实现几乎所有形式的精确基因编辑方面的有效性，例如碱基转换（所有类型）、DNA序列插入和删除、染色体易位和倒置以及基因组内安全港位点的长DNA序列插入。在植物科学中，PE可以作为精确基因编辑的突破性工具，允许创建所需的等位基因以改善作物品种。然而由于效率因素，其应用受到限制。
近日，来自韩国庆尚国立大学的研究人员在Plant Biotechnology Journal上发表了题为“Prime editing: Mechanism insight and recent applicationsin plants”的综述论文。该文讨论了PE的分步机制，阐述步骤关键点，提出了提高PE效率的解决方案。此外还概述了植物PE研究的最新进展和未来前景，并探究了其应用的关键技术考虑因素。
在基于CRISPR/Cas9的基因组编辑系统的所有衍生系统中，先导编辑是独一无二的。PE利用SpCas9，可在目标位点生成R环，并在非目标链（nCas9 （H840A） 版本）上生成单链断裂 （SSB），用于与引导编辑向导 RNA （pegRNA） 结合。非目标链的SSB释放3’单链末端，该末端可以与pegRNA 3′ 延伸的引物结合位点（PBS）退火，该pegRNA预先设计为包含PBS和逆转录酶（RT）要安装到基因组位点中的所需碱基的模板。然后，与 nCas9（H840A）融合的 RT 肽通过将脱氧核苷酸添加到与RT模板代码相对应的切口末端的3′-OH来引导异源双链。从头开始合成产物表现为3′ flap结构，可以通过与5′ 切口末端的原始序列竞争而固定到基因组中。理论上，PE可以用于各种类型的精确基因编辑，例如各种类型的碱基替换、DNA序列插入和删除。
图1. PE机制概述
首先作者讨论了PE分步机制，以及提高PE编辑效率的方法。PE编辑过程中存在多步关键点，包括引导、逆转录酶进行RNA依赖性DNA聚合，从头合成链固定到基因组等多个步骤，通过一些关键点的改进有助于提高PE编辑效率。引导过程中PBS和间隔序列之间的分子内互补性可能对PE蛋白和pegRNA的组装构成风险，存在自抑制但可以通过截断PBS来缓解影响。3′ PBS-RT模板延伸是pegRNA的末端序列，对引物退火和启动RT至关重要，对pegRNA3’末端的保护有助于提高PE效率。逆转录过程中添加RNA伴侣有助于RT酶的工作，来提高PE活性。RNase H结构域的消除或截断可能会抑制pegRNA的降解，提高PE活性，此外PE蛋白构型以及RT酶的来源也影响到PE性能。最影响PE效率的是DNA修复过程，引入双pegRNA策略可以显著提高PE效率。
图3. 使用双pegRNA和主要变体的PE方法
PE系统早期在植物中的应用主要为单子叶植物，包括小麦、水稻和玉米，在这些作物中PE技术表现出有效性和稳定性。但在双子叶植物中PE系统应用进展缓慢，效率非常低。此后PE2和PE3/3b在植物中产生与PE相似的编辑效率，并且尝试了包括PPE和ePPE，并引入双pegRNA，许多植物领域开创性的PE工作促进了单子叶植物精准育种。双pegRNA策略可以显著提高基于PE的精确序列插入的效率和长度限制。基于配对PE的PrimeRoot方法能够将大DNA片段精确插入到所选的基因组位点中，有助于在新的植物育种时代显着加速精确的从头驯化。
图4. SSR介导的精确DNA插入方法
PE在植物中的应用存在一些技术问题。植物细胞壁会阻碍PE系统等大分子复合物的传递，原生质体介导有助于更高的PE活性介导转化但原生质体的制备、再生存在很多限制。粒子轰击、农杆菌介导转化都存在植物再生等问题，有效的递送方法对植物PE应用至关重要。此外由于PE蛋白以及pegRNA较大，对于不同靶点编辑效率也存在差异。PE系统使用单个或配对的切口酶，通常会导致较低水平的脱靶，但不能完全排除脱靶效应的发生，特别是当使用可能模仿DSB的双pegRNA时，更容易发生错误修复。对单个位点或成对使用额外的pegRNA还包含更多潜在的脱靶位点或不需要的产物。
在植物中，PE提供了一种高精度和高效的方法来引入特定的DNA变化，例如植物基因组中所有类型的碱基转换、DNA序列插入或删除、基因替换以及精确的DNA序列整合。除了引入核苷酸变化之外，PE还可以用于植物体内定向诱变和植物中的位点特异性基因调控。此外，PE系统可用于用可见或抗原标记来标记内源蛋白质，以进行蛋白质定位、功能和相互作用的原位研究。通过对作物基因组进行精确修饰，PE系统可以加快改良作物品种的开发，提高产量、营养成分、抗病虫害、除草剂抗性和对非生物胁迫的耐受性。
