2023年5月10日，浙江大学殷学仁教授团队在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“A dramatic decline in fruit citrate induced by mutagenesis of a NAC transcription factor, AcNAC1”的研究论文。该研究揭示了猕猴桃NAC转录因子家族成员AcNAC1通过转录激活一个具有柠檬酸转运功能的AcALMT1参与果实柠檬酸积累的分子机制，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变AcNAC1基因获得低柠檬酸型猕猴桃。该研究对于进一步通过代谢工程手段调控果实酸度具有重要的参考意义。

柠檬酸是一种常见的初级代谢物，同时也是衡量风味品质的重要指标。不同于其他果实，发育阶段早期的猕猴桃果实中柠檬酸含量极低，随着发育过程呈现持续积累模式，并成为猕猴桃成熟果实中总酸度的主要贡献者，因此明晰果实的有机酸代谢及调控机制对实现不同酸度果实育种具有重要意义。该研究系统分析了不同品种猕猴桃(Actinidia spp.)发育过程中主要有机酸组分（柠檬酸、苹果酸、奎宁酸）的动态变化，结合基因共表达网络分析获得一个编码铝激活的苹果酸转运蛋白的AcALMT1基因，其表达量在柠檬酸积累阶段显著上调，猜测该基因参与了猕猴桃果实的柠檬酸积累进程。但其他植物和果实的研究中，ALMT普遍被认为是苹果酸转运蛋白。因此，我们利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系及电生理实验分析，明确了AcALMT1具有转运柠檬酸的功能，且在猕猴桃果实中柱组织中瞬时过量表达AcALMT1可显著增加柠檬酸含量。

通过基因表达关联分析发现，AcALMT1的表达水平与17个候选转录因子高度相关。随后的双荧光素酶和EMSA实验表明，NAC转录因子AcNAC1通过直接结合AcALMT1的启动子来显著激活其表达。对不同品种猕猴桃组织样品进行有机酸含量测定发现，AcALMT1和AcNAC1高表达的果实组织中积累了更多的柠檬酸。此外，NAC1表达水平与柠檬酸含量的相关性也在番茄群体中得到了验证。

为了进一步证实AcNAC1在柠檬酸积累中的贡献，该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得了靶向突变AcNAC1基因、且快速开花的猕猴桃植株。这些基因编辑猕猴桃果实中的柠檬酸水平显著下降，而苹果酸和奎宁酸含量没有受到明显影响。该研究发现了AcALMT1作为柠檬酸转运体的新功能，并揭示了AcNAC1-AcALMT1的转录激活调控是猕猴桃中柠檬酸积累的主要原因。后续，利用这些材料，通过自交选育，有望获得非转基因的低酸猕猴桃。

浙江大学博士研究生傅蓓凌和博士后王文球为论文共同第一作者，殷学仁教授为论文通讯作者。果实有机酸及候选基因关联分析工作得到了美国佛罗里达大学李响博士、浙江大学园艺系李绍佳研究员的支持；非洲爪蟾卵母细胞表达体系及电生理实验得到了浙江大学农学系沈秋芳研究员和王一洲研究员的支持；植物材料管理工作得到了浙江大学农业实验站李坤峰老师的支持；新西兰植物与食品研究所Andrew Allan院士、浙江大学园艺系刘晓芬博士和博士研究生齐彤辉参与了该研究过程。本论文研究得到了国家重点研发计划（2018YFD1000200）、国家自然科学基金（32072635；32102344）、浙江省重点研发计划（2021C02015）、中国博士后派出项目计划（2020107）、浙江省育种专项（2021C02066-8）和中央高校基本科研业务费专项资金（226-2022-00152；226-2022-00215）等项目的资助。

文章来源：植物生物技术Pbj