近日，东北农业大学陈庆山/武小霞/赵莹研究团队在植物学权威期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为《Design of high-monounsaturated fatty acid soybean seed oil using GmPDCTs knockout via a CRISPR-Cas9 system》的论文。介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制高单不饱和脂肪酸、低多不饱和脂肪酸大豆新种质的研究结果。
大豆油分中脂肪酸的组成和含量决定了其营养价值和稳定性。大豆脂肪酸主要包括多不饱和脂肪酸 (PUFAs, 62%)，单不饱和脂肪酸 (MUFAs, 23%) 和饱和脂肪酸 (SFAs, 15%)。与单不饱和脂肪酸油酸 (C18:1) 相比，多不饱和脂肪酸亚油酸 (C18:2) 和亚麻酸 (C18:3) 易于氧化致使豆油变劣，降低大豆油的使用性和减少保存期限，且在高温加热的时候会产生对人体不利的反式脂肪酸。因此，从营养和贮藏角度等综合考虑，提高单不饱和脂肪酸 (C18:1) 的含量，适量降低多不饱和脂肪酸 (C18:2) 及 (C18:3) 的含量，更能优化大豆油脂的品质。
PDCT基因是油脂合成代谢过程中的关键基因，其编码的磷脂酰胆碱甘油二酯胆碱磷酸转移酶催化二酰甘油 (DAG) 和磷脂酰胆碱 (PC) 间胆碱磷酸头部的交换，使DAG中油酰基进入PC经过酰基编辑再次形成DAG ，从而在DAG及三酰甘油 (TAG) 中富集PC修饰的多不饱和脂肪酸。目前除了模式植物拟南芥、海甘蓝、菥蓂等，PDCT基因家族在其他高等植物中研究报道较少，对他们的功能尚缺乏全面深入的了解。该研究大豆基因组中共鉴定出2个PDCT基因，命名为GmPDCT1及GmPDCT2。表达模式分析发现，GmPDCT1/GmPDCT2基因主要在种子中表达，尤其在种子发育中后期表达量更高，预示其在调控大豆种子油分组成中发挥的重要作用。
以GmPDCT1/GmPDCT2基因为靶标，在其PAP2保守结构域设计了2个靶点，并构建了双基因双靶点基因编辑载体，通过农杆菌转化大豆品系DN50，T0代共获得15株阳性植株 (转化效率25%)。利用Sanger测序检测产生的突变，在15株阳性植株中，其中有7株 (编辑效率为46.7%) 在目标位点检测到突变，以碱基插入及缺失为主，均为双基因敲除突变体，其中大多数T0代突变均稳定遗传到T1-T2代，同时也在T1及T2代中发现了新的突变，均为翻译提前终止型突变体。利用GC-MS分析了3个突变单株种子的脂肪酸组分，突变体种子中的油酸含量显著升高，为野生型的2.49倍，亚油酸、亚麻酸含量显著降低。本研究还检测了高油酸突变体的主要农艺性状，发现敲除GmPDCT1/ GmPDCT2基因并不影响大豆株高、叶形、花色、粒长、粒宽、种子总蛋白和总油分含量等。
脂质组检测分析发现，与野生型相比，突变体TAG中C18:1含量显著提高，C18:2及C18:3含量显著下降；突变体DAG和PC中16:0/18:1和18:1/18:1等分子种的含量显著提高，16:0/18:2、16:0/18:3和18:2/18:2等含量显著下降，说明GmPDCTs敲除会降低磷脂酰胆碱衍生的DAG (PC-derived DAG)，进而抑制PC修饰后的多不饱和脂肪酸进入TAG合成途径。这些结果揭示了GmPDCTs在改善大豆脂肪酸组分中的关键作用，为全面、深入解析植物PDCT基因家族的功能提供了理论依据。
东北农业大学陈庆山教授、武小霞研究员、赵莹副教授为本论文的通讯作者，东北农业大学硕士研究生李海博、博士研究生周润南为本论文的共同第一作者，东北农业大学博士研究生刘沛言、杨明亮副教授、辛大伟研究员、刘春燕副研究员、张战国副教授也参与了研究工作。该研究受到了国家重点研发计划项目(2021YFF1001202, 2021YFD1201104-02-02)、国家自然科学基金 (U20A2027, 31971899, 32272093, 32272072)及黑龙江省自然科学基金(TD2022C003, JJ2022YX0475) 的支持。
文章来源：植物生物技术Pbj
