生物信号在生命细胞中随着时间的推移而发生。然而，目前大多数用于探究生物学特别是基因表达的方法都是使用一些破坏性技术，在单个时间点上量化信号，不能持续的记录生物信号的发生。最近一种名为Retro-Cascoder的技术突破了这一限制， Retro-Cascorder通过使用逆转录事件转换为DNA条形码，利用逆转录酶和CRISPR-Cas整合酶将该事件存储在单向扩展的CRISPR阵列中运作。后期可以通过测序检索这些基于CRISPR数组的基因表达情况。

近日，在Nature Protocol在线发表了题为“Temporally resolved transcriptional recording in E. coli DNA using a Retro-Cascorder”的文章，作者描述了一种Retro-Cascoder记录生物信号的实现方式，详细介绍了实现这项技术所需的分子组件，提供了生成记录并通过Illumina测序检索数据的逐步指南，并说明了如何使用定制软件从测序数据中推导相对的转录时序。该记录示例只需2天即可生成，制备测序文库和测序可以在2-3天内完成，数据分析需要数小时。该协议可以由熟悉基本细菌培养、分子生物学和生物信息学的人员实施。数据分析可以在个人计算机上最小化地运行。

细胞通常通过基因表达的变化对内外刺激作出反应。这些变化可以是简单和孤立的事件，长期以来，生物学家一直试图通过分析基因表达来深入了解细胞及其环境。这种分析需要测量特定RNA转录物的丰度，通常通过破坏细胞膜来物理收集可量化的RNA。然而，破坏细胞进行分析有一个不幸的后果:同一细胞或细胞谱系不能在多个时间点上进行分析，并且必须在事件正在进行且RNA保留时收集细胞。因此，实验人员不容易收集基因表达级联的时间数据或重建细胞过去发生的刺激驱动事件。

分子记录仪是基因表达破坏性分析的一种选择。这些分子技术随着时间的推移不断记录生物活动，并将数据存储在DNA中。通过将生物事件(如基因表达)与同一细胞内的永久基因组修饰联系起来，分子记录仪可以在整个生物过程中收集数据。不同的分子记录仪记录数据的机制各不相同，使用重组酶、核酸酶、启动编辑酶或整合酶。作者在本文中重点研究了Retro-Cascorder，它使用大肠杆菌Cas1-Cas2整合酶来编写事件，利用这些整合酶的自然方向性来按照事件发生的顺序编码事件。

Cas1-Cas2整合酶是聚集规律间隔短回文重复序列(CRISPR)细菌免疫系统的重要组成部分。在噬菌体入侵时，这些整合酶捕获噬菌体DNA的小片段，并将它们整合到称为CRISPR阵列的基因组库中。逆转录转录酶RT特异性作用于结构非编码RNA (ncRNA)，逆转录酶识别并将其部分逆转录成单链DNA的短片段。根据研究者的实验要求对原始ncRNA进行修改， ncRNA逆转录生成DNA片段，可以通过Cas1-Cas2整合酶捕获并整合到细菌基因组中的CRISPR阵列中。如果这种修饰的逆转录ncRNA是由感兴趣的启动子驱动的，则只有当启动子活跃时，逆转录衍生的间隔片段才会在CRISPR阵列中积累。这些逆转录ncRNA被进一步修饰，通过改变不参与逆转录或整合的内部碱基来创造序列的多样性。这些变化产生了不同的条形码逆转录ncRNA，可以在单个细胞内运作。当不同的启动子驱动不同条形码的逆转录ncRNA表达时，条形码的逆转录衍生间隔子根据不同启动子的活性顺序在CRISPR阵列中积累。转录事件的相对顺序可以通过在稍后的时间点对CRISPR阵列进行测序来重建。因此，通过结合Cas1-Cas2整合酶的独特功能和逆转录RT, Retroc-Cascorder可以捕获活细胞内特定生物事件的顺序信息。

研究者之前已经证明，Retro-Cascorder可以成功地重建细菌中诱导转录事件的时间关系。作者破译了多种诱导剂的表达顺序，包括无水四环素、氯化胆碱和水杨酸钠，这些启动子也可以被其他感兴趣的启动子所取代。因此，这项技术可以用于生物传感器的建设，以监测不同刺激的发生和顺序，如污染物或病原体。随着工程量的增加，为了提高采集效率，Retroc-Cascorder也可能有分辨率跟踪内源性基因在细菌中的表达。同时，该系统也存在一定的限制因素，比如需要在细菌中共表达多个质粒，可能会抑制细菌的生长；Cas1-Cas2的低获取效率等等。

图1 Retro-Cascorder实验和计算流程。

综上，作者详细介绍了Retro-Cascorder的基本组成、相关的实验设计、测序、分析方法等，也与一些相似的生物技术做了比较，如TRACE和record -seq。详细的操作流程可以参考原文内容。

文章来源：植物生物技术Pbj