第二信使——钙离子（一）

2023年4月19日 0条评论 877次阅读 0人点赞

本文主要为大家介绍第二信使里面的Ca²⁺,主要围绕钙信使系统，钙信号的产生、终止和传递途径以及钙信号的“编码”与“解码”3个方面为大家讲解（图中橙色部分），感兴趣的童鞋可以好好阅读本文噢！

在之前的推文“植物信号转导概述——学习植物的交流方式”一文中，小远给大家承诺过后面会给大家详细讲解受体类型以及第二信使的相关内容，今天小远就是来兑现承诺的，如果大家感兴趣，小远愿意给大家一一讲清楚，感兴趣的童鞋可以在文末留言噢！本期的文章小远想要给大家介绍的是第二信使以及第二信使里面的Ca²⁺，Ca²⁺大家应该比较熟悉，因为在文献中出现的频率比较高，就是不知道大家对Ca²⁺的理解有多深，为了帮助大家理解，小远整理了下面的内容给大家，希望对大家的科研有所帮助噢！

第二信使的概念及常见类型

配体与受体结合后并不进入细胞内，但能间接激活细胞内其它可扩散、并调节信号转导蛋白活性的小分子或离子，这些在细胞内传递信号的分子称为第二信使。例如水溶性激素无法通过质膜，其受体只位于靶细胞的表面，因此水溶性激素无法直接进入细胞内发挥作用。然而，许多水溶性激素在与靶细胞膜上相应的受体结合后，形成激素-受体复合物，该复合物可以通过某种手段激活定位在细胞膜内侧一种特定的酶（如图1中的腺酸环化酶），从而导致一些小分子物质的合成（如图1中的cAMP）。这些小分子物质一旦从酶的活性中心被释放出来，就可代替原来的激素行使功能。如果把激素看成是第一信使（first messenger），随后合成的小分子物质就可以看成是第二信使（second messenger），而催化第二信使合成的酶可称做效应器（effectors）。

图1 激素引发的信号转导过程。激素（第一信使）与受体结合形成激素受体复合物，复合物激活腺苷酸环化酶，ATP在腺苷酸环化酶的作用下生成cAMP（第二信使），cAMP激活cAMP依赖的蛋白激酶A，进而引起细胞的各种生物反应。

第二信使迅速、忠实、有效地传播细胞受体接收到的信息。它们是小的、非蛋白质的有机分子或离子，可以与特定的目标蛋白质结合，以各种方式改变其活动，使它们能够对受体接收到的信息作出适当的反应。

第二信使相对于蛋白质的一个关键优势是，与蛋白质不同，第二信使的水平是由快速动力学控制的。因此，尽管一个蛋白质的水平可能需要几十分钟才能显著增加，但大多数第二信使的水平在微秒（例如，离子）到秒（例如，DAG）内增加。它们通常是由细胞中丰富的前体产生的，或从含有高浓度第二信使的存储器中释放出，所以它们的生成不受速率限制。因此，当接收到适当的信号时，第二信使迅速产生，迅速扩散，并高效地改变靶蛋白功能。

钙离子（Ca²⁺）、肌醇-1,4,5-三磷酸（IP₃）、二酯酰甘油（DAG）、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、环腺苷磷酸核糖（cADPR）、NO等由胞内底物被效应器酶降解而来的一系列小分子物质及其代谢产物等都属于第二信使。

钙信使系统

钙信使系统是植物细胞中研究最多的胞内信使系统。胞质中的Ca²⁺不仅是一种重要的矿质元素，参与调节植物细胞的结构和代谢，而且其作为一种第二信使在植物细胞信号转导中也起着核心作用。

2.1

细胞的钙转移系统

细胞内自由Ca²⁺的分布与转移是形成Ca²⁺信号的基础，只有对此有所了解后，才能讨论Ca²⁺信号的产生和终止过程。

2.1.1钙在植物细胞中的分布

通常细胞内的钙（总钙）以结合态和自由离子（Ca²⁺）两种形式存在，且分布不均匀。细胞内的Ca²⁺浓度不能太高，溶质中Ca²⁺浓度如果太高，会与细胞内的磷酸根产生沉淀，而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的，所以细胞内Ca²⁺浓度过高对细胞有害，甚至会致死。细胞内的钙绝大部分以结合态的形式存在，如与钙结合蛋白、内质网、线粒体、叶绿体，特别是与液泡结合，这些都是细胞内的“钙库”。“钙库”中钙含量很高，但游离Ca²⁺浓度不高。在静息条件下，细胞质中游离钙离子浓度（[Ca²⁺]_cyt）维持在100~200nmol·L^-1之间，而细胞外和某些细胞器内的储存的Ca²⁺浓度可以达到胞质内Ca²⁺浓度的10⁴~10⁵倍。

Ca²⁺平时以结合态的形式结合在这些细胞器上，它的迅速释放和螯合对维持细胞内Ca²⁺浓度的稳定平衡及Ca²⁺的信使作用起一个很大的钙缓冲作用(Bush Douglas S., 1995)。“钙库”中Ca²⁺的缓冲能力主要是与一类对Ca²⁺高容量、低亲和力的贮钙蛋白有关。由于它们对Ca²⁺的低亲和力，故当“钙库”中钙通道开放时，钙蛋白能迅速地和钙解离，将Ca²⁺释放到胞质中去，使Ca²⁺信号能准确、迅速的传递。

图2 Ca²⁺在动植物细胞信号转导过程中的定位与动员(Rudd J J and V. E. Franklin-Tong., 1995)。这幅细胞的卡通图使用了伪彩色比例（如比例条所示），以表示该细胞的细胞质和细胞器内的钙浓度。它包含在已知的μM到mM范围内存储Ca²⁺的细胞器。这些红色细胞器表示高[Ca²⁺]（见比例尺）。静止或未受刺激的细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]_i或[Ca²⁺]_cyt）的浓度一般被认为是100~200nM（如图蓝色所示；见比例尺）。这种低的[Ca²⁺]_i至少部分是通过Ca²⁺-ATPase（钙泵）的作用来维持的，钙泵催化质膜内侧的ATP水解，释放出能量，驱动细胞内的钙离子泵出细胞或者泵入内质网腔中储存起来，以维持细胞内低浓度的游离Ca²⁺。细胞外的Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_e）显著高于静止细胞的细胞质[Ca²⁺]_i。信号分子和受体之间的相互作用（如图所示的细胞表面）可能导致Ca²⁺内流。这是通过“打开”存在于外周质膜中的Ca²⁺通道来实现的，这导致了[Ca²⁺]_i的局部增加，如颜色编码所示。Ca²⁺-ATP酶的作用是将[Ca²⁺]_i恢复到基础水平。信号分子也可以与受体相互作用，导致Ca²⁺从细胞内存储的动员。在动物和植物细胞中，可动员Ca²⁺的主要的细胞器被认为是不同的。动物细胞被认为主要从内质网和/或肌浆内质网（SR）中释放Ca²⁺。然而，植物细胞似乎使用液泡作为主要的可移动的Ca²⁺存储场所，尽管有一些新的证据表明它们也使用存储在内质网中的Ca²⁺。如前所示，细胞内存储的Ca²⁺可以通过IP3和cADPR的生成来动员。这些第二信使与位于细胞内Ca²⁺存储上的特定受体（IP3R和RyR）相互作用。这些受体形成离子通道，通过离子通道Ca²⁺被释放到细胞质中，导致空间（和时间）定义的[Ca²⁺]_i的增加，如伪彩色图所示。将质膜受体与IP3R连接起来的虚线箭头表明，该途径（S）在植物中并没有得到很好的表征。这些[Ca²⁺]_i介导的升高可能与诱导细胞对细胞外信号的特异性反应相关。

注：细胞内以及细胞外Ca²⁺浓度的检测可以参考上一期的文章“荧光蛋白的升级用法”中关于Ca²⁺的部分，这里就不再具体展开讲解了！

2.1.2钙转移系统

胞质Ca²⁺信号的运转包括：Ca²⁺流入和Ca²⁺从胞质中的流出，Ca²⁺的运输方式大致包括以下3种：①钙离子通道：利用电子传递产生的电化学势梯度将Ca²⁺主动泵进细胞器内，它存在于线粒体或叶绿体上；②Ca²⁺-ATPase（钙泵）：依靠水解ATP提供能量，将Ca²⁺泵出胞质。钙泵存在于质膜和内质网上，它的最适pH值为8，能被Na₃VO₄所抑制；③Ca²⁺／H⁺反向传递子：利用已建立的质子电化学势梯度，实现Ca²⁺与H⁺的跨膜交换，将Ca²⁺泵出胞质。它主要分布在液泡膜上，也可能存在于质膜和高尔基体上(Bush Douglas S., 1995)。从理论上说，Ca²⁺的流入和流出系统是钙信号的主要动力学特征。由于具有缓冲能力，钙结合蛋白是细胞内[Ca²⁺]_cyt的最主要调节者，对Ca²⁺运输途径的研究主要在液泡膜、ER膜、细胞质膜等对[Ca²⁺]_cyt的调节。当然，Ca²⁺通过内膜系统如：内质网膜、线粒体膜的流动对于研究Ca²⁺信号的运输模式也是很重要的(Santella Luigia and Ernesto Carafoli., 1997)。

图3 质膜与细胞器上的Ca²⁺泵和Ca²⁺通道，控制细胞内Ca²⁺的分布和浓度：膜上Ca²⁺泵将膜内的钙泵出细胞，质膜上Ca²⁺通道控制Ca²⁺内流，细胞器膜的Ca²⁺泵将胞质中的Ca²⁺积累在细胞器（胞内钙库）中，Ca²⁺通道则控制Ca²⁺外流。

2.1.2.1Ca²⁺离子的流入

[Ca²⁺]_cyt的增加主要是通过细胞膜上钙离子通道的Ca²⁺的流入和内部“钙库”上Ca²⁺的释放或二者同时起作用。

Ca²⁺从胞外内流是通过细胞质膜钙离子通道。钙离子通道是一种结合蛋白，它通过构象变化呈开放或关闭状态，从而控制Ca²⁺流动。在钙通道关闭时，胞外Ca²⁺以非特异性渗漏形式进入细胞内，数量甚微；钙离子通道开放时，Ca²⁺以扩散形式按一定的扩散差从胞外涌入胞内。植物细胞内，特别是在液泡膜和细胞质膜上的Ca²⁺离子通道具有可渗透性，属于配体门通道。钙离子通道主要位于质膜系统和内膜系统，下面详细介绍一下植物质膜系统和内膜系统上的钙离子通道。

（1）细胞质膜系统上的钙离子通道：在细胞质膜上至少有两种类型的钙离子通道(White P J., 1998)，一是高亲和性低选择力的离子通道(White P J., 1994)；二是选择性较高的单一性离子通道，一般它的亲和力较低。

（2）内膜系统上的钙离子通道：在液泡膜上至少有两种不同的钙离子通道(Allen G J and D. Sanders., 1997)，其中有两个是受体门控钙离子通道，一是以1,4,5-三磷酸（InsP3）作为离子载体；二是以环ADP核糖体（cADPR）作为离子载体(Allen Gethyn J and Dale Sanders., 1994)。

2.1.2.2 Ca²⁺离子的流出

Ca²⁺的流出主要通过Ca²⁺运转体的作用，Ca²⁺运转体主要有“钙泵”和Ca²⁺／H⁺方向运转体，这两种运转体最大的不同在于它们的动力学特性。Ca²⁺／H⁺方向运转体适合于在胞内Ca²⁺浓度高时起运转作用，它是高容量、低亲和力（K_m=10～15μmol／L）的；“钙泵”则是低容量、高亲和力的（K_m=0.1～2μmol／L)。Ca²⁺运转体的作用是：①在信号转导过程中补充由钙离子通道从“钙库”流入胞质的Ca²⁺进入“钙库”；②将[Ca²⁺]_cyt恢复到静息态水平；③为专一的生物化学反应提供足够的Ca²⁺和其余二价阳离子；④为膜的相互作用（如：膜泡运输和膜泡融合等）提供Ca²⁺。

钙信号的产生、终止和传递途径

钙信号的产生和终止是细胞内Ca²⁺增减、波动的结果。当细胞受到外部刺激时，从质外体经质膜或胞内“钙库”向胞液运输的Ca²⁺量增加，胞质中Ca²⁺浓度提高后，通过激活Ca²⁺调节的靶酶，Ca²⁺依赖的蛋白激酶（CDPK或pKCa²⁺）或蛋白磷酸酶，或与Ca²⁺受体蛋白（如：CaM）结合，再通过激酶将Ca²⁺浓度变化所蕴含的外界信息表达为生理生化过程，完成信息传递之后，Ca²⁺通过细胞中浓度调节又回落到静息态水平，这时Ca²⁺与受体蛋白分离。这样通过Ca²⁺在胞质内的浓度变化，可以把细胞外的信息传递到细胞内，调节相应的生理过程。对应不同的外界环境刺激，细胞可以产生各种在时间及空间上存在差异的钙信号，这些钙信号具有不同的亚细胞定位、时间间隔、振幅和频率，因此被称为“钙指纹”。

钙信号的“编码”与“解码”

植物细胞感知胞外环境变化后，会编码特异的“钙指纹”，被胞内钙离子感受器识别后，通过“解码”过程启动下游各种生理反应来应对环境变化。

根据逻辑顺序应该先讲钙信号的“编码”，但是“编码”这个过程相对复杂，而多年来，钙信号是如何通过钙结合蛋白“解码”已经被广泛研究，钙信号的解码是通过各种Ca²⁺结合蛋白实现。在植物中，Ca²⁺结合蛋白主要分为响应元件（sensor responder）和传感元件（sensor relay）两类蛋白。前者通过与Ca²⁺的结合改变自身激酶活性或构象直接调控下游，主要包括钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinase，CDPK）；后者与Ca²⁺结合后，还必须与目标蛋白相互作用才能调控下游信号，主要包括钙调素（CaM）和钙调磷酸酶B类似蛋白（calcineurin B-like，CBL）。这些蛋白通过与Ca²⁺的结合，改变自身或目标蛋白的活性，进而调控下游目的基因的表达，最终使细胞能够产生特异的信号响应(Batistič Oliver and Jörg Kudla., 2012)。

下面以栾升教授研究组20多年来对植物钙信号解码的研究，发现并构建了复杂的Ca²⁺-CBL-CIPK信号转导网络为例，带大家简单了解一下！

细胞钙（Ca²⁺）信号几乎调节着真核生物生理的各个方面。在所有情况下，Ca²⁺信号传导都具有一个复杂的传导链，包括一系列感知细胞外信号的受体和Ca²⁺可渗透通道，这些通道通过质膜将Ca²⁺输送到细胞内或从细胞内存储释放Ca²⁺，形成特定的Ca²⁺信号(Tang Ren-Jie and Sheng Luan., 2017)。细胞Ca²⁺标记的下游是Ca²⁺结合蛋白，它们与效应蛋白相互作用，触发特定的生化反应，导致细胞反应(Luan Sheng., 2009；DeFalco et al., 2010)。在植物中，Ca²⁺信号通路显得尤为重要，因为它为固着生物通过修改其灵活的发育程序来快速响应和适应不断变化的环境提供了不可或缺的机制(Luan Sheng., 2009；Dodd et al., 2010)。植物细胞中胞质Ca²⁺升高短暂而明确的模式被认为是下游反应所必需和充分的“第二信使”(Gilroy Simon and Anthony Trewavas., 2001；Luan et al., 2002；Sanders et al., 2002；Kudla et al., 2018)。

许多环境条件，如生物和非生物胁迫，往往会引起具有特定时空特征的Ca²⁺第二信使。这些不同的Ca²⁺信号可以以尖峰、波和振荡的形式编码，由Ca²⁺传感器和效应器解析，从而导致特定的响应。在高等植物中已经发现了一些Ca²⁺传感器家族，包括钙调素（CaM）和CaM样蛋白（CMLs）(Zielinski, Raymond E., 1998；Luan et al., 2002；McCormack et al., 2005)、Ca²⁺依赖蛋白激酶（CDPKs）(Harmon et al., 2000；Cheng et al., 2002；Harper et al., 2004)和更神秘的钙调神经磷酸酶B样蛋白（CBLs）(Kudla et al., 1999；Trewavas Anthony., 1999；Luan et al., 2002)。为了确定CBL家族Ca²⁺传感器的功能特性，一个新的植物特异性CBL相互作用蛋白激酶家族（CIPKs）作为主要的下游信号成分(Shi et al., 1999)。进一步的遗传研究已经确定了CBL-CIPK信号系统在调节植物对不利环境条件的适应性反应中的核心作用。自1999年CBL-CIPK网络被发现以来，近20年来的研究明确了CBL-CIPK模块在Ca²⁺信号转导过程中的分子机制，并揭示了该Ca²⁺信号网络促进植物对环境变化的响应和适应的各种生理过程，特别是在植物细胞的膜转运过程中。

图4 CBL-CIPK信号网络对植物细胞膜转运过程的调控(Tang et al., 2020)。环境中的许多离子胁迫条件，如土壤中的低K⁺或高Na⁺，都会触发胞质Ca²⁺浓度的快速升高，这被解释为一种“信号”。不同的Ca²⁺信号可以通过不同的CBL-CIPK复合物来感知和解码，并根据不同的亚细胞位置来靶向不同的转运蛋白。在质膜中，多个膜转运过程受到CBL-CIPK网络的调控：CBL1/9-CIPK23复合物磷酸化并激活K⁺通道AKT1和K⁺转运体HAK5以增强K⁺摄取；CBL4/SOS3-CIPK24/SOS2复合物刺激Na⁺/H⁺交换器SOS1将过量的Na⁺挤出细胞。在NO₃^–浓度波动下，CBL9-CIPK23复合物磷酸化硝酸盐转运体CHL1，并改变其对NO₃^–的转运亲和力和感知能力。为了响应高NH₄⁺，CBL1-CIPK23抑制AMT1型NH₄⁺转运体的活性，以避免NH₄⁺的过度积累。在低Fe²⁺但其他重金属过量的情况下，CIPK23介导的IRT1磷酸化是IRT1随后泛素化和降解所必需的。在保卫细胞中，CBL1-CIPK5和CBL1/9-CIPK23复合物分别通过激活外部K⁺通道GORK和阴离子通道SLAC1来调节K⁺和阴离子流出。低K和高Na在液泡膜中启动额外的CBL-CIPK信号通路：CBL2/3-CIPK3/9/23/26复合物通过TPK型K⁺通道和其它K⁺转运蛋白激活液泡存储中的K⁺再动员；CBL10-CIPK24复合物靶向一个未知的Na⁺转运体，将Na⁺分配到液泡中。在液泡中，Mg²⁺的分离也受到一系列液泡CBL2/3-CIPK3/9/23/26模块的正调控。不同颜色的小球表示不同的离子。星号表示蛋白质磷酸化。虚线和问号表示尚待识别的不确定路径或未知组件。缩写：ABA，脱落酸；AIP1，AKT1相互作用蛋白磷酸酶1；AKT1，拟南芥K⁺转运蛋白1；CBL，钙调神经磷酸酶B样蛋白；CIPK，CBL相互作用蛋白激酶；COl1，毒素不敏感1；GIPC，糖基肌醇磷酸化神经酰胺；GORK，门控向外整流的K⁺通道；HAK5，高亲和K⁺转运蛋白5；IRT1，铁调节转运蛋白1；JA，茉莉酸；KC1，K⁺型整流通道1；PYL，PRY1样；PYR1，帕雷巴克汀抗性1；SLAC1，慢速阴离子相关通道1；SLAH3，SLAC1同源物3；SOS，盐过度敏感；SYP121，植物合成121；TPK，两孔K⁺通道。

然而，钙信号是如何编码出来的？这个问题很复杂，要研究钙信号的编码机制，其关键是发掘介导钙离子进出细胞或者细胞器的钙通道和转运蛋白，研究他们的“开”与“关”的机制。后面的推文我们再来讨论钙信号的编码机制。

小远叨叨

关于钙信号，小远在这篇文章中做了一个系统的介绍，当然并不全面，因为很多知识都很丰富，没办法一一展开，大家如果想要更深入地了解，可以按照小远的每一级标题去查阅相关的文献，今天的推文到这里就结束了，后面我们再继续介绍钙信号的编码机制噢！

References：

Allen G J, Sanders D. Two voltage-gated, calcium release channels coreside in the vacuolar membrane of broad bean guard cells[J]. The Plant Cell, 1994, 6(5): 685-694.

Allen G J, Sanders D. Vacuolar ion channels of higher plants[M]//Advances in Botanical Research. Academic Press, 1997, 25: 217-252.

Bush D S. Calcium regulation in plant cells and its role in signaling[J]. Annual review of plant biology, 1995, 46(1): 95-122.

Batistič O, Kudla J. Analysis of calcium signaling pathways in plants[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 2012, 1820(8): 1283-1293.

Cheng S H, Willmann M R, Chen H C, et al. Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family[J]. Plant physiology, 2002, 129(2): 469-485.

DeFalco T A, Bender K W, Snedden W A. Breaking the code: Ca2+ sensors in plant signalling[J]. Biochemical Journal, 2010, 425(1): 27-40.

Dodd A N, Kudla J, Sanders D. The language of calcium signaling[J]. Annual review of plant biology, 2010, 61: 593-620.

Gilroy S, Trewavas A. Signal processing and transduction in plant cells: the end of the beginning?[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001, 2(4): 307-314.

Harmon A C, Gribskov M, Harper J F. CDPKs–a kinase for every Ca2+ signal?[J]. Trends in plant science, 2000, 5(4): 154-159.

Harper J F, Breton G, Harmon A. Decoding Ca2+ signals through plant protein kinases[J]. Annu. Rev. Plant Biol., 2004, 55: 263-288.

Kudla J, Becker D, Grill E, et al. Advances and current challenges in calcium signaling[J]. New Phytologist, 2018, 218(2): 414-431.

Kudla J, Xu Q, Harter K, et al. Genes for calcineurin B-like proteins in Arabidopsis are differentially regulated by stress signals[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(8): 4718-4723.

Luan S, Kudla J, Rodriguez-Concepcion M, et al. Calmodulins and calcineurin B–like proteins: Calcium sensors for specific signal response coupling in plants[J]. The Plant Cell, 2002, 14(suppl_1): S389-S400.

Luan S. The CBL–CIPK network in plant calcium signaling[J]. Trends in plant science, 2009, 14(1): 37-42.

McCormack E, Tsai Y C, Braam J. Handling calcium signaling: arabidopsis CaMs and CMLs[J]. Trends in plant science, 2005, 10(8): 383-389.

Rudd J J, Franklin-Tong V E. Calcium signaling in plants[J]. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 1999, 55: 214-232.

Sanders D, Pelloux J, Brownlee C, et al. Calcium at the crossroads of signaling[J]. The Plant Cell, 2002, 14(suppl_1): S401-S417.

Santella L, Carafoli E. Calcium signaling in the cell nucleus[J]. The FASEB Journal, 1997, 11(13): 1091-1109.

Shi J, Kim K N, Ritz O, et al. Novel protein kinases associated with calcineurin B–like calcium sensors in Arabidopsis[J]. The Plant Cell, 1999, 11(12): 2393-2405.

Tang R J, Luan S. Regulation of calcium and magnesium homeostasis in plants: from transporters to signaling network[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2017, 39: 97-105.

Tang R J, Wang C, Li K, et al. The CBL–CIPK calcium signaling network: Unified paradigm from 20 years of discoveries[J]. Trends in Plant Science, 2020, 25(6): 604-617.

Trewavas A. How plants learn[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(8): 4216-4218.

White P J. Calcium channels in the plasma membrane of root cells[J]. Annals of Botany, 1998, 81(2): 173-183.

White P J. Characterization of a voltage-dependent cation-channel from the plasma membrane of rye (Secale cereale L.) roots in planar lipid bilayers[J]. Planta, 1994, 193(2): 186-193.

Zielinski R E. Calmodulin and calmodulin-binding proteins in plants[J]. Annual review of plant biology, 1998, 49(1): 697-725.

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