杂草通过自身一些抗性基因对农业除草剂的快速适应是自然界的一种普遍现象。大穗看麦娘（A. myosuroides）就是一种在谷类作物中表现很极端的杂草，它有可能在短短几代的时间里就表现出抵抗力。靶标抗性（TSR）是一种具有强烈的表型反应，在这种快速的适应性反应中起着重要作用。随着测序技术的发展，现在能够在数百个个体中使用PacBio的长读扩增子测序技术从而破译TSR突变发生的基因组背景。然而，使用PacBio测序单个扩增子不仅昂贵而且费时的，因此对多数量的样本进行一些位点的扩增子单独测序是不切实际的。
近日，来自德国马克斯·普朗克生物研究所Detlef Weigel团队在国际著名杂志Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Deep haplotype analyses of target-site resistance locus ACCase in blackgrass enabled by pool-based amplicon sequencing”的研究文章，文章报道了使用基因混池的方法提供了TSR扩增子可靠的等位基因频率。
在农业中使用除草剂以来，许多植物物种已经进化出对这些化学物质的抗性。导致快速适应并表现抗性的两种主要机制是非靶点抗性(NTSR)和靶点抗性(TSR)。NTSR是指降解或物理上阻止活性成分达到其目标的过程，NTSR通常涉及多个基因，抗性通常是定量的。TSR具有更多的定性效应，例如对高水平除草剂的抗性为特征，并且可以追溯到改变除草剂靶标酶中单个氨基酸的大效应基因突变。更罕见的是，TSR与靶标酶的过表达有关。第一个 TSR 突变是在psbA基因中发现的。在随后的几十年中，在其他基因中发现了 TSR 突变，包括 L-微管蛋白基因，乙酰乳酸合酶(ALS),乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。在某些情况下，只有一种氨基酸图突变被发现具有抗除草剂性，而在其他基因(包括ALS和ACCase)中，几个残基的突变可导致抗除草剂性。许多杂草进化出了对多种除草剂的独立抗性都是由此产生的，比如大穗看麦娘。实际上，在杂草A. myosuroides对ACCase抑制剂的广泛抗性极大地限制了有效控制杂草的能力。芳氧基苯氧基丙酸酯(FOPs)，苯基吡唑啉(DENs)和环己二酮(DIMs)都通过抑制ACCase 脂肪酸阻断催化活性合成的第一步。在A. myosuroides中，具有Trp2027Cys和Ile2041Asn突变的植物能够表现出对FOPs和DENs的抗性，而Gly2096仅赋予对FOPs的抗性。
为了进行测试，研究者从之前的研究中选择了9个群体，并将22-24个独立测序个体中确定的ACCase单倍型与从200个个体池中推断出的ACCase单倍型进行了比较。每个种群在温室里单独播种。然后，我们从每株植物中收获4周大的叶组织，并在DNA提取之前将它们聚集在每个种群中。接下来扩增出了一个约14 kb的长片段，其中包括CDS上游585 bp、32个外显子和31个内含子(12.5 kb)、下游364 bp。对每个池使用直接双索引，后来允许在单个 SMRT 单元上多路复用所有池。并特别注意合并来自所有池的相似数量的PCR扩增子，在合并池之前，通过使用Qubit fluorometer和额外的凝胶电泳来确定扩增子浓度进行交叉验证。然后创建PacBio 扩增子库，上机测序。由于使用的是由数百个个体组成的池，因此下游分析严重依赖于每个个体读取的精度。因此，可以将输入 HiFi reads的质量提高到Q30(≥99.9% 的准确率)。为了比较群体之间的单倍型频率，我们将所有HiFi reads归一化到读数据最少(16000 reads)的池中，对应于样本中每个扩增子的平均读深度为40。由于 HiFi reads的最常见错误类型是均聚物环境中的indels，我们应用了进一步的过滤器，包括“minimum-cluster-read-count 20”(每个单倍型预期深度的一半)和“minimum-cluster-frequency 0.00125”，来表示读取的比例以支持我们的数据集中的真正集群(图一)。
图一、测序和分析基因混池中长读数扩增子的工作流程
总的来说，本研究描述了一个可以适应任何感兴趣的基因，独立于生物体的高通量PacBio扩增工作流程。以TSR基因ACCase为例验证了该方法的可行性，研究提供了详细的实际操作实验室协议来扩增和长读序列位点，以及在多达200个样本的池中使用软件pbaa的分析建议。我们将该工作流程应用于德国的A. myosuroides种群。除了一些低频的单体型，本方法能够恢复我们测试池中的所有的单体型。此外，我们在几乎所有种群中都发现了由软件分析发现的TSR。通过SLiM模拟，我们证明这些 TSR 突变可能持续数十年到几个世纪，这取决于它们的起始等位基因频率，即使当进化选择不再被适用。因此，强烈建议杂草管理策略不能仅仅依靠除草剂的施用，还应将机械杂草管理与作物轮作结合起来，采用化学和非化学措施相结合的方法，使杂草在田间的生长率持续降低。
