2022年10月，国际权威学术期刊New Phytologist发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛（Cell | 一箭双雕！重磅研究揭示植物磷信号网络调控菌根共生的分子机制！Nature | 突破！中科院植生所王二涛团队揭示豆科植物与根瘤菌共生固氮的关键模块！）团队的最新相关成果，题为A PHR-regulated receptor-like kinase, OsADK1 is a required for mycorrhizal symbiosis and phosphate starvation responses的研究论文。
大多数陆地植物与丛枝菌根真菌共生，以确保矿质养分的获取，尤其是磷的获取。以磷酸盐饥饿反应(PHR)为中心的网络调控丛枝菌根(AM)共生。
植物体内形成了一个以AtPHR1/OsPHR2为中心，众多其它调控因子参与的磷饥饿响应调控网络，但OsPHR1/2/3在AM共生中起主调控作用的分子机制仍不清楚。
在本研究中，我们利用转录组深度测序和DNA亲和纯化测序鉴定了水稻转录因子OSPhr1/2/3在AM共生过程中的520个直接靶基因。这些基因参与了内酯的生物合成、转录重编程和双向营养交换。此外，我们还确定了受体样激酶（RLK）OsADK1是OsPHR1/2/3的新靶点。凝胶迁移率改变分析和反式激活分析表明，OsPHR2可以直接与OsADK1启动子中的P1BS元件结合来激活其转录。OsADK1似乎是菌根定植和丛枝发育所必需的。此外，水培实验表明，OSADK1可能参与了植物对磷的饥饿反应.我们的发现证实了OsPHR1/2/3作为菌根相关基因的主要调节者参与了共生的不同阶段，并发现了一个新的参与AM共生和植物磷饥饿反应的受体样激酶。
大约80%-90%的陆地植物可以与丛枝菌根真菌建立互惠共生关系。AM真菌通过广泛的菌丝分枝在根内皮层细胞内形成被称为丛枝的有序的树状结构。寄主植物和AM真菌之间进行活跃的营养交换。AM真菌从宿主植物获得脂肪酸和糖形式的碳骨架，以维持自身的生长和发育。作为回报，AM真菌为宿主植物提供矿物质营养，如磷和氮。除了AM特异性诱导转录因子外，植物磷酸盐饥饿反应的关键调控因子OsPHR1、OsPHR2和OsPHR3已被证明对AM共生至关重要。
遗传分析表明，Osphr1/2-1/3三元突变体中只有罕见的小而异常的丛枝形成，表明OsPHR1/2/3在AM共生中起主调控作用，然而其分子机制仍不清楚。
通过转录组深度测序(RNA-seq)和DNA亲和纯化测序(DAP-seq)分析，我们发现了OsPHR1/2/3的一个靶点OsADK1 (Arbuscular Development Kinase1)，它编码一个受体样激酶。我们进一步表明，OsPHR2可以直接调节AM共生中OsADK1的表达。遗传分析表明，OsADK1控制AM共生中的丛枝发育。
结果1：深度转录组测序鉴定OsPHR1/2/3 AM相关靶基因
为了研究OsPHR1/2/3在AM共生中的作用，我们对AM定殖和非定殖的野生型和三重突变体进行了转录组测序。
图1：（a）基因型之间比较，共获得1106个DEGs，其中743个在AM定殖的野生型中上调。894个在AM定殖的三突变体中上调， 570个下调。比较AM+和AM-中野生型和三突变体的转录组，发现5716个(AM+)和5499个(-AM)差异表达基因。（b）GO富集分析：胞吐作用和细胞代谢过程均明显丰富由OsPHR1/2/3 Inc.调控的菌根反应基因包括33个已知参与菌根共生不同阶段的基因。参与木霉内酯生物合成的编码酶基因(CCD7和CCD8a)编码共同共生信号通路组分的基因(DMI3和Cyclops)下游转录因子基因(WRI5A、Rad1和、NSP2)、与脂肪酸生物合成有关的基因(FATM和RAM2)。此外，在三重突变体中，包括ARK1在内的几个保守的受体样激酶基因的表达下调。总之，我们的数据表明，OsPHR1/2/3控制菌根共生中的接触前阶段、共生信号通路、丛枝发育和养分交换。
结果2：OsPHR1/2/3直接靶向菌根相关基因的DAP-Seq鉴定
图2：（a）两个重复鉴定了22,892个基因座和25,424个基因座，有21,145个共同的目标基因重叠。（b/c）OsPHR2结合位点在靶基因的转录起始点附近富含，在远端的基因间隔区和外显子区域占优势，表明OsPHR2结合位点在启动子区域强烈富含。(d) 在RNA-seq数据库中，将DAP-seq鉴定的基因与AM定植过程中菌根调控的基因进行比较，结果显示520个基因可能是OsPHR2的直接靶标，其中382个基因上调，138个基因下调。(e) 520个共享基因中，有478个基因也受到OsPHR1/2/3的调控，其中19个基因是由AM共生诱导或参与AM共生的。（f/g）我们在OsWRI5A、OsADK1启动子区域检测到强烈的OsPHR2结合峰。
图3：（a）对OsADK1启动子序列的研究发现了一个与OsPHR2结合的P1BS元件。（b）为了测试OsPHR2是否直接与OsADK1启动子结合，我们用含有P1BS基序的OsADK1启动子片段和重组麦芽糖结合蛋白(MBP)单独或与OsPHR2融合进行了凝胶迁移率改变分析(EMSA)。我们证实，OsPHR2可以与含有P1BS的OsADK1启动子片段结合，但不能与P1BS的突变体结合，表明OsPHR2与P1BS元件特异结合。（c/d）我们还进行了荧光报告分析，以确定OsPHR2是否能够激活植物中OsADK1的表达。我们检测到Pro35S：OsPHR2有很强的Luc活性，表明OsPHR2通过与其启动子结合而直接激活OsADK1的表达。
结果4：OsADK1是一种功能激酶，诱导菌根共生过程
图4：（a）在SMart的电子分析数据库中显示，OsADK1含有一个介于349和617个氨基酸之间的酪氨酸激酶结构域。因此，我们评估了OsADK1是否在体外具有激酶活性，结果证实HIS-TF-OsADK1自身磷酸化表明OsADK1是一种受体样激酶。（b）系统发育分析表明OsADK1存在于菌根植物的基因组中，但在包括拟南芥在内非菌根植物中不存在，表明OsADK1在AM共生中发挥作用。（c-f）我们用qRT-PCR方法研究了OsADK1在菌根定植和非定植野生型根中的表达。在接种后4周和6周，相对的OsADK1转录本在菌根定植的根中强烈积累，并随着野生型定植的进展而增加。我们还确定了菌根共生诱导OsADK1的表达依赖于OsPHR1/2/3，这与OsADK1是OsPHR1/2/3在菌根共生中的靶标一致。
结果5：OsADK1是菌根定植和丛枝菌根定植所必需的
图5：与野生型相比，Osadk1-3和Osadk1-4突变株表现出严重的菌根定植缺陷。进一步研究表明，与野生型相比，Osadk1突变体中丛枝的形成和内部真菌菌丝进入皮层的比例较低与野生型相比，水稻早晚共生标记基因OsAM1、OsAM3、OSP T11、OsHA1和OsARK1以及真菌基因RiEF1的转录水平一直都要低得多野生型的丛枝以30-40μm大小为主，而Osadk1突变体中10-20μ大小的丛枝所占比例增加。表明OsADK1在丛枝植物发育过程中起着至关重要的作用。综上所述，提示OsADK1在AM真菌感染和丛枝发育中是必需的。
鉴于OsADK1受OsPHR2的直接调控，我们还探讨了OsADK1在植物磷饥饿反应中的作用。无论何种磷供应条件，OsADK1都表现出结构性低表达。但在缺PI条件下，OsADK1在地上部被显著诱导，Osadk1突变体在PI缺乏或PI过剩的条件下，植物生长都没有受到影响。然而，在PI缺乏和PI充足的条件下，Osadk1突变体中磷饥饿诱导基因OsSQD2、OsPT2和OsIPS1的表达显著低于野生型，表明OsADK1调控PI饥饿反应基因的表达。
丛枝菌根共生需要寄主植物与AM真菌之间的信号交换，包括寄主植物根部分泌的链霉内酯和菌根真菌分泌的Myc因子。共生信号在质膜上被感知，并激活根瘤菌共生和AM共生之间的共享信号通路，称为共生信号通路(CSSP)，并通过激活下游AM特有的转录因子来启动菌根共生特有的反应。在这里，我们的发现强调了OsPHR1/2/3通过直接调控AM共生中的一系列靶基因，在接触前阶段、信号转导、丛枝发育和营养交换中的重要作用。我们通过RNAseq和DAP-seq鉴定了520个由OsPHR1/2/3直接调控的菌根反应基因。在这520个基因中，我们发现了编码植物内酯生物合成酶CCD7和CCD8a的基因，这表明OsPHR1/2/3通过控制植物分泌信号的生物合成来调节接触前的过程。OsPHR1/2/3作为菌根相关基因的主要调控基因，参与菌根共生的各个阶段。综上所述，目前的数据表明，植物对磷的饥饿反应在丛枝菌根共生的建立中起着关键作用。
到目前为止，大多数研究都集中在AM共生过程中感知Myc因子所需的受体蛋白激酶(RKs)和受体样蛋白(RLKs)，例如水稻中的MYR1和CERK1，元宝草中的LYK9，番茄和杂交番茄中的LYK10。在这项研究中，我们通过挖掘RNA-seq和DAP-seq数据集来识别AM共生所需的核锁定的RLK。OsADK1功能缺失突变导致丛枝形成急剧减少和丛枝形态异常，表明OsADK1是AM共生的主要参与者。我们还探讨了OsADK1在PI饥饿反应中的作用，我们观察到磷饥饿诱导基因OsSQD2、OsPT2和OsIPS1在Osadk1突变体中的表达显著降低，表明OsADK1可能参与了植物磷信号转导。
然而，OsADK1是否在Myc因子受体下游发挥作用，以及OsADK1的底物是什么，还有待于进一步研究。
总之，本研究证实了OsPHR1/2/3作为菌根相关基因的主要调节者参与了共生的不同阶段，并发现了一个新的参与AM共生和植物磷饥饿反应的RLK。
文章来源：Ad植物微生物
