二萜类化合物，尤其是松香烷型二萜（雷公藤甲素，脱氢松香酸，鼠尾草酚等），在结构和立体化学上具有丰富多样性，为药物发现提供了丰富的来源。次丹参酮二烯（miltiradiene）是松香烷型二萜重要的骨架前体物质，由相关二萜合酶催化香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP)生成，并于2009年由黄璐琦院士团队首次在药用植物丹参中发现。在植物体内，次丹参酮二烯的合成途径可分为两步反应。反应第一步是由Class II 类合酶，柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase, CPS)，催化 GGPP的质子化环化形成柯巴基焦磷酸((+)-copalyl diphosphate, (+)-CPP)；反应第二步是由Class I类合酶，类贝壳杉烯合酶(kaurene synthase like, KSL)催化 (+)-CPP 的离子化起始的环化反应生成次丹参酮二烯。迄今，CPS 和 KSL 蛋白已经从丹参、雷公藤等多种被子植物中发现并确定功能，而双功能次丹参酮二烯合酶，仅在石松类植物卷柏Selaginella moellendorffii中发现，并命名为SmMDS。二萜合酶功能的多样性与其蛋白质结构密切相关，其催化反应呈现高度的底物构象选择性和产物立体专一性。从结构生物学和生物化学角度研究二萜合酶，揭示二萜合酶的底物构象选择、产物单一特性等催化机制，对于活性二萜天然产物的化学合成和酶合成具有重要意义。
近日，中国中医科学院黄璐琦院士团队联合中国科学院生物物理研究所江涛研究员团队、首都医科大学高伟教授团队在Plant Biotechnology Journal发表题为Structural and mechanistic insights into the precise product synthesis by a bifunctional miltiradiene synthase的研究论文。该研究解析了SmMDS在不结合底物状态及结合底物GGPP状态的两种晶体结构，首次揭示了植物来源二萜合酶真实底物的结合状态。另外，基于结构及生化实验证据，该研究提出了双功能二萜合酶中间产物(+)-CPP在两个活性口袋之间可能的运输机制，并揭示了Class I活性口袋如何精细调节碳正离子催化生成单一产物的分子机制。
双功能的SmMDS含有α、β、γ三个结构域，该蛋白同时包括有催化活性的Class I和Class II结构域，其中Class II活性区域位于β和γ结构域交界处，底物 GGPP在此发生反应生成(+)-CPP；Class I 活性区域位于α结构域，(+)-CPP在α结构域催化生成终产物次丹参酮二烯（图1）。在解析的含有GGPP的晶体结构中，底物GGPP可以很好地构建在Class Ⅱ活性口袋。通过对组成Class II活性区域的氨基酸进行突变研究，发现除DXD391D392motif外，Lys478、Tyr521、His335、Trp381等关键氨基酸也参与了GGPP的动态催化过程。
图1，SmMDS整体结构和Class II类活性位点的关键氨基酸
通过分析SmMDS结构，研究团队在两个活性口袋之间发现了一个相对连续的通道（图2）， 通道出口位于αβ界面。研究团队通过对通道最狭窄处的氨基酸Leu437和通道的出口处的氨基酸Lys820 和 Arg824进行突变实验，证明 (+)-CPP可能通过该通道进入Class I活性口袋，从而使得βγ和α模块的整合赋予SmMDS 更高的次丹参酮二烯生产效率。
图2，(+)-CPP 通道和 SmMDS 的 Class I 类活性位点。
Class I 活性位点位于α结构域，(+)-CPP在此被转化为次丹参酮二烯。研究团队将(+)-CPP和miltiradiene对接到SmMDS结构中，并对(+)-CPP周围关键氨基酸，如Thr608、Glu690、Ser717、His721、Tyr837等进行定点突变。通过鉴定突变蛋白催化GGPP生成的产物，确认了copal-15-yl+和pimar-15-en-8-yl+ 是Class I类活性区域反应的关键中间体。研究团队基于蛋白结构和功能实验，提出了(+)-CPP到次丹参酮二烯催化过程所涉及的碳正离子中间体以及关键氨基酸的精细调控过程，见图3。
图3，(+)-CPP到次丹参酮二烯的催化机制和中间体1、3的确认
中国中医科学院黄璐琦院士，中国科学院生物物理所江涛研究员，首都医科大学高伟教授为本文的共同通讯作者。首都医科大学童宇茹副教授，中国科学院生物物理所马小丽助理研究员为本文的共同第一作者。胡添源博士、陈康博士、徐海峰博士、苏平副研究员和崔光红研究员参与了相关研究工作。该研究得到了中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设”、国家自然科学基金、国家重点研发计划项目的支持。
