近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由山东农业大学姚玉新课题组撰写的“Ethylene increases the NaHCO3 stress tolerance of grapevines partially via the VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10 pathway”论文。该研究工作评价了乙烯在调控葡萄NaHCO3胁迫中的作用，并阐明了VvERF1B调控NaHCO3胁迫的分子途径。VvERF1B过量表达能显著提高VvPMA10转录水平和PMA活性，增强葡萄NaHCO3胁迫耐受能力。VvERF1B不能直接转录激活VvPMA10，而是通过VvMYC2间接调控。VvERF1B与VvMYC2蛋白互作，互作增强了VvMYC2激活VvPMA10表达的能力。该团队首次揭示了以“VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10”为核心的抗碱性盐途径。这一发现不仅提供了葡萄抗碱性盐的新途径，而且对葡萄抗碱性盐种质的创制和改良具有重要实用价值。
该团队前期研究结果表明，NaHCO3胁迫显著诱导葡萄根中VvACS3的转录和乙烯释放。为了阐明乙烯在调控葡萄NaHCO3抗性上的作用，研究者使用ACC(乙烯合成前体物质)和1-MCP(乙烯信号传导抑制剂)处理葡萄扦插苗。结果表明，ACC有效缓解了NaHCO3处理对叶片的伤害，而1-MCP加剧了叶片伤害。在NaHCO3和NaHCO3+ACC处理中，根系PMA活性显著高于对照组根系（图1a）。此外，NaHCO3+ACC处理48h，培养基出现大面积黄色区域，而在NaHCO3处理中没未观察到（图1b），表明施用ACC促进H+分泌。NaHCO3+ACC处理的根系分泌物中草酸含量显著高于NaHCO3处理（图1c）。另外，在NaHCO3处理下，过表达VvACS3显著提高葡萄根系中的PMA活性，促进H+和草酸分泌（图1d-f）。综上所述，乙烯增加了PMA活性，促进NaHCO3胁迫下的H+和草酸盐分泌。
图1 NaHCO3胁迫下葡萄根系及愈伤组织中PMA活性、H+及草酸含量变化
VvERF1B的表达不仅受NaHCO3胁迫诱导，也受乙烯诱导（图2a-c）。为揭示VvERF1B在调控NaHCO3抗性过程的功能，研究者获得了VvERF1B过量表达的葡萄株系。100 mM NaHCO3处理5天后，野生型株系叶片表现失绿表型，转基因株系受伤害较轻（图2d）。VvERF1B过表达降低MDA含量，提高H+-ATPase活性，促进H+外流和草酸的分泌（图2e-h）。为进一步阐明VvERF1B的功能，研究者获得了VvERF1B过表达和突变的转基因葡萄愈伤组织。在NaHCO3胁迫下，与野生型愈伤组织相比，过表达愈伤组织的生长受到的抑制程度较小，但突变愈伤生长受到严重抑制（图2i）。PMA活性、H+和草酸分泌存在相似的变化趋势（图2i-m）。以上结果表明，过表达VvERF1B提高了H+-ATP酶活性，促进H+外排，诱导草酸分泌，进而增强了葡萄对NaHCO3胁迫耐受能力。
图2. VvERF1B在提高NaHCO3胁迫抗性中的作用
VvERF1B过表达葡萄根系中，VvPMA10转录水平显著上调（图3a）。并且，在葡萄愈伤组织中，VvERF1B过表达上调了VvPMA10转录，而VvERF1B突变则降低了其表达（图3b）。因此，VvPMA10可能是VvERF1B的靶基因。尽管VvPMA10启动子存在2个ERE原件，EMSA和Y1H实验表明，VvERF1B不能直接结合VvPMA10启动子ERE元件。
获得了7条VvPMA10过表达根系，选取表达水平较高的两条根系（OE2和OE5）用于进一步研究（图3c）。与野生型根系相比，在NaHCO3胁迫下转基因根系受到的损伤更小，MDA含量更低（图3d，3e）。VvPMA10过表达显著提高了根系PMA活性、H+外流速率及草酸分泌水平（图3f-h）。VvPMA10过表达能增强葡萄愈伤组织NaHCO3胁迫抗性（图3i，3j），表现为提高的生长量、PMA活性、草酸和H+分泌水平（图3 k-o）;而VvPMA10突变产生了相反的结果（图3m-o）。以上结果表明，VvERF1B并不能直接结合VvPMA10启动子，VvPMA10正调控葡萄根系及愈伤组织的碱性盐抗性。
图3 VvPMA10在增加葡萄根系和愈伤组织NaHCO3胁迫抗性性中的作用。
为了阐明VvERF1B调控VvPMA10表达的分子途径，研究者利用Y1H筛选VvPMA10的上游转录因子，并获得了候选转录因子VvMYC2(VIT_215s0048g02820)。VvPMA10启动子上存在多个MYC2结合元件(2个G-box、4个E-box和4个MYC)；Y1H试验表明，VvMYC2结合到G-box(CACGTG)元件上（图4a），EMSA和荧光素酶(LUC)试验也验证了这一结果（图4b，c)。
VvMYC2的表达受NaHCO3胁迫诱导（图4d）。为了鉴定VvMYC2调控NaHCO3胁迫的功能，获得了VvMYC2过量表达和突变的转基因愈伤组织（图4e）。与WT愈伤组织相比，VvMYC2过表达显著提高了愈伤组织的生长量，VvMYC2突变明显抑制了愈伤组织抗性。VvMYC2过表达显著上调了VvPMA10表达，增强PMA活性，促进草酸和H+分泌，而VvMYC2突变则导致相反的结果。以上结果表明，VvMYC2通过转录激活VvPMA10提高葡萄NaHCO3抗性。
图4 VvMYC2转录激活VvPMA10表达及其抗盐功能鉴定
研究者发现，VvERF1B和VvMYC2不存在转录调控关系，但二者蛋白互作（图5a）。为了评价VvERF1B-VvMYC2蛋白复合体的功能，研究者获得了VvERF1B和VvMYC2共同过表达，VvERF1B过表达且VvMYC2突变的葡萄愈伤组织。
基于表型分析发现，与WT愈伤组织相比，VvERF1B或VvMYC2过表达提高了NaHCO3胁迫抗性（图5b-d）。与VvERF1B或VvMYC2单独过表达相比，二者同时过表达提高了葡萄愈伤组织对NaHCO3胁迫的耐受能力；在VvERF1B过表达的愈伤组织中突变VvMYC2，降低了VvERF1B诱导的NaHCO3抗性（图5b-d）。此外，同时过表达VvERF1B和VvMYC2显著增加了VvPMA10表达、PMA活性、草酸盐和H+分泌（图5b-e）。因此，VvERF1B通过促进VvMYC2介导的途径增强了NaHCO3抗性。
图5 VvERF1B-VvMYC2复合物对VvPMA10表达和NaHCO3抗性的影响
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14565
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图文来源：植物生物技术Pbj
