PBJ | 华中农大邢永忠课题组联合四川农科院任光俊团队克隆水稻穗发芽调控基因CCT30

2024年12月6日 0条评论 65次阅读 0人点赞

近日，Plant Biotechnology Journal 杂志在线发表了由华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室、崖州湾国家实验室邢永忠教授课题组联合四川省农业科学院作物研究所任光俊研究员团队撰写的“The transcription factor CCT30 promotes rice preharvest sprouting by regulating sugar signalling to inhibit the ABA-mediated pathway”论文。该研究通过对前期鉴定到的调控水稻穗发芽的主效QTL qPSR8 进行精细定位（Gao et al., 2008），克隆了该QTL位点的候选基因CCT30。研究者通过对CCT30 转基因材料休眠表型的鉴定，证实了CCT30 促进水稻穗发芽的新功能。进一步的ABA含量及可溶性糖含量测定、外源ABA及葡萄糖处理分析，以及ABA通路和糖代谢相关基因表达量检测等，明确了CCT30通过增强糖信号、抑制ABA的合成及信号途径从而减弱种子的休眠、促进水稻穗发芽。此外，研究发现CCT30与转录因子OsbZIP37相互作用，它们协同调控下游基因，负向调节水稻种子休眠。研究团队报道的这一关于水稻穗发芽调控基因CCT30克隆及机制解析的工作，为培育水稻抗穗发芽品种提供了重要基因和理论基础。

《PBJ | 华中农大邢永忠课题组联合四川农科院任光俊团队克隆水稻穗发芽调控基因CCT30》

种子休眠是在种子成熟过程中，随着贮藏物质的积累而开始的，是一种使种子保持静止状态直到条件适宜才萌发的适应性性状(Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006)。在持续多雨和潮湿的天气下，成熟的种子直接在穗上发芽，这种现象被称为穗发芽（Pre-harvest sprouting，PHS）(Gubler et al., 2005)。PHS不仅影响作物产量和籽粒品质，还影响种子贮存及发芽率，对作物生产造成较大经济损失(Sohn et al., 2021; Tai et al., 2021)。分析环境因素和内部因素等多种因素对种子休眠和萌发的调控机制是解决水稻穗发芽问题的基础。在水稻种子受精后20 ~ 30天胚乳中淀粉和蛋白质大量积累，种子中水分逐渐流失，这一阶段中遇到炎热潮湿的环境种子很容易发芽，导致PHS(An et al., 2020; Tao et al., 2022)。GA主要促进种子萌发，而ABA在诱导种子休眠中起关键作用(Farooq et al., 2022; Shu et al., 2016)。ABA的生物合成、分解代谢和信号转导与种子成熟、诱导初级休眠和种子萌发密切相关。种子萌发和幼苗形成伴随着储存在胚乳中的淀粉的降解过程（Tai et al., 2021）。具有高抗性淀粉的胚乳消耗淀粉较慢，产生可溶性糖较少，从而延迟种子萌发(Pan et al., 2018)。此外，胚乳中积累的可溶性糖能够下调ABA应答基因的表达，降低对ABA的敏感性，最终导致PHS的发生(Du et al., 2018)。华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室、崖州湾国家实验室邢永忠教授课题组联合四川省农业科学院作物研究所任光俊研究员团队克隆了水稻穗发芽的关键基因CCT30并阐明了其通过调控糖信号和ABA途径进而调控穗发芽的机制，为穗发芽相关研究工作的开展以及抗穗发芽水稻品种的培育奠定了重要的理论基础。全文主要研究结果如下：
1.      穗发芽主效QTL qPSR8 的克隆
前期已经将一个主效水稻穗发芽QTL qPSR8 定位到1.5 cM的区间，为进一步缩小定位区间，研究者将G46B与K7481杂交，构建了5412株的F2群体（Gao et al., 2008）。G46B的穗发芽率为88.5%，K7481的穗发芽率为7.3%。利用SSR标记RM447和RM3754对5412株F2单株进行分型，筛选得到重组单株76株。再进一步使用2个SSR标记（RM23517、RM23520）和6个基于qPSR8 新设计的标记对重组单株进行基因分型。最终，qPSR8 被精细定位到标记P1和P3之间28.5 kb的范围内（图 1a），Nipponbare基因组注释信息表明，该区域只有一个基因，LOC_OsO8g42440，其编码一个C端含有CCT结构域、N端含有B-BOX结构域的蛋白CCT30（图 1b）。为了明确候选基因CCT30 的功能，研究者构建了CCT30 近等基因系背景的互补材料以及ZH11背景的敲除材料和超量表达材料。将G46B基因型的CCT30的启动子和基因序列构建到互补载体中，并将其转化至携带K7481等位基因背景的近等基因系NIL-1242中。发芽实验结果表明，NIL-1242互补系新收获的种子休眠程度明显弱于NIL-1242系（图 1c，d）。此外，利用新鲜收获的转基因材料种子的进行穗发芽表型考察以及发芽情况统计，结果显示CCT30 敲除突变体种子的休眠程度明显高于对照野生型（图 1e-g），CCT30 超量表达植株种子的表型则相反（图 5g,h），证实CCT30 是qPSR8 位点的候选基因，该基因正向调控穗发芽、负调控种子休眠。
《PBJ | 华中农大邢永忠课题组联合四川农科院任光俊团队克隆水稻穗发芽调控基因CCT30》
图1 qPSR8 的精细定位及休眠程度鉴定

2.      CCT30参与ABA通路
为了研究CCT30 对ABA的敏感性，将野生型ZH11和CCT30 敲除突变体在开花后30天（30 DAF）新鲜收获的种子用5 μM ABA处理。CCT30 敲除突变体种子萌发受到的抑制程度强于ZH11（图 2a，b），表明CCT30 敲除突变体对ABA的敏感性高于野生型ZH11。CCT30 过表达则降低了种子萌发过程中ABA的敏感性，且CCT30 过表达植株种子的ABA含量低于野生型（附 S2）。相反，GA（600 uM）对CCT30 敲除突变体种子的萌发影响不显著（附 S6）。此外，在15 DAF时，CCT30 敲除突变体种子中ABA生物合成途径基因和ABA信号通路基因的表达显著高于野生型（图 2c，d）。这些结果支持了CCT30 敲除突变体通过ABA介导的途径增强水稻种子休眠的结论。
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图3 糖对CCT30 基因敲除突变体种子休眠的影响

4.      CCT30 与OsbZIP37蛋白互作
利用截短的CCT30蛋白进行酵母双杂交文库筛选，最终筛选到bZIP类转录因子OsbZIP37（图 4a）。酵母双杂交实验结果表明互作发生在OsbZIP37的bZIP结构域外的区域与CCT30的BBOX结构域之间（图 4b）。随后，研究者利用BiFC实验和LCI实验证实了全长的CCT30蛋白与OsbZIP37蛋白在细胞核发生互作（图4c，d）。
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图4 CCT30与OsbZIP37蛋白互作的验证

5.      OsbZIP37负调控种子休眠
为了探究OsbZIP37是否也参与了种子休眠的调控，研究者构建了不同表达水平的OsbZIP37 超量表达株系和OsbZIP37 敲除突变体（图 5a, b）。与对照相比，超表达株系种子的发芽率随着OsbZIP37 表达水平的增加呈梯度增加，而OsbZIP37 敲除突变体种子的休眠程度却明显增强（图 5c-f）。由此可知，OsbZIP37与CCT30一样，在水稻种子休眠中起负调控作用。
为了探讨CCT30与OsbZIP37相互作用的生物学意义，研究者创建了一组ZH11背景下的转基因材料（附 S11），比较CCT30 敲除突变体（CCT30-CR ）、过表达植株（CCT30-OX ），OsbZIP37 敲除突变体（OsbZIP37-CR ）、过表达植株（OsbZIP37-OE ）以及同时敲除OsbZIP37 和过表达CCT30 （CCT30-OX/bzip37-cri ）的植株种子的休眠程度。同批次的发芽表型考察、ABA通路关键基因表达水平检测以及淀粉水解基因表达水平检测的结果再次证实，CCT30和OsbZIP37负调控水稻种子休眠（图 5）。与OsbZIP37-CR 相比，CCT30-OX/bzip37-cri 的发芽率有所提高（图 5g，h），表明超量表达CCT30 部分回补了OsbZIP37 敲除导致的休眠程度增加的表型。此外，CCT30和OsbZIP37参与种子休眠调控的共同下游基因OsTPS1 和OsDOG1L-3的表达在CCT30-CR 和OsbZIP37-CR 中被上调，在CCT30-OX 和OsbZIP37-OE 中被下调，而在CCT30-OX/bzip37-cri 中与ZH11相似（附 S13）。表明CCT30通过与OsbZIP37相互作用，协同调节这些基因的表达，调控种子的休眠和萌发。
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图5 OsbZIP37相关转基因植株新鲜收获种子的休眠鉴定

这项研究基于图位克隆的方法，克隆了调控水稻穗发芽的新基因CCT30，并进一步解析了其调控机制以及挖掘了其互作蛋白OsbZIP37，丰富了调控水稻种子休眠和萌发的遗传和分子机制，并为水稻抗穗发芽育种和遗传研究提供了新的靶点。
华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室、生命科学技术学院樊晓伟博士（现就职于河南农业大学生命科学学院），四川省农业科学院作物研究所高方远研究员以及华中农业大学博士研究生刘月欣为论文共同第一作者，宋颂博士、任光俊研究员以及邢永忠教授为该研究工作的共同通讯作者。研究工作得到了农业生物育种国家科技重大专项、国家自然科学基金和湖北洪山实验室项目的资助。
论文链接：https://doi.org/10.1111/pbi.14521
References:

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图文来源：植物生物技术Pbj

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