Fig3：AtBeclin1介导的后减数分裂期绒毡层程序性细胞死亡（PCD）的延迟，导致了早期花粉流产和随后的花药不开裂。

(a-c) 从不同花药发育阶段获取的半薄切片（石蜡包埋10微米切片）显示了控制组（WT）(a, i-vii)、雌性（MS）(b, i-vii) 和 F1 (MS × RS)(c, i-vii) 的绒毡层PCD。

(d) 成熟花药的内皮层次级细胞壁（ESW）增厚和定向，在 WT (i)、MS (ii) 和 F1 (MS × RS)(iii) 中展示。

(e) Phloroglucinol-HCl染色的雌性（MS）-1DPA花蕾花药和切片 (i, ii) WT, (iii, iv) MS 和 (v, vi) F1 (MS × RS)。

(f) WT、MS 和 F1 (MS × RS) 的-1 DPA花蕾花药切片中的内皮层厚度。

(g 和 h) 条形图表示成熟花药（-1DPA）和幼叶中木质素含量的定量估计。

(i) 条形图显示WT、MS 和 F1 (MS × RS) 的不同花药发育阶段中GhNST1基因的qRT-PCR表达分析。TS表示四分体阶段；TDS表示绒毡层退化阶段；ADS表示花药开裂阶段；E表示表皮；En表示内皮层；Ml表示中层；T表示绒毡层；Tds表示四分体；Msp表示小孢子；aMsp表示异常小孢子；Ps表示花粉囊；PG表示花粉粒；aPG表示异常花粉粒；St表示孔膜；Sm表示隔膜。

在显微镜分析中，观察到MS花药中的绒毡层退化延迟引起的花粉形态异常，而通过在F1代中表达COP1L105A抵消了BECLIN1的效应，从而恢复了花粉的正常发育，与WT相似。这些发现揭示了植物雄性生殖发育中BECLIN1的关键作用及其通过改变活性氧平衡和抑制绒毡层PCD引起的早期花粉异常。

Fig4: AtBECLIN1通过影响活性氧平衡和抑制绒毡层程序性细胞死亡（PCD）引起发育中花粉粒的缺陷。

(a–c) 在不同花蕾发育阶段（从四分体花粉到成熟二核花粉）的花药及其相应花粉粒表型，包括 (a) 对照（WT），(b) 雌性（MT），和 (c) F1（MS × RS）。

(d–f) 在不同花药发育阶段的ROS（H2O2）积累水平比较，涉及 (d) WT，(e) MS，和 (f) F1（MS × RS）。

(g–i) 通过TUNEL检测（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记）在WT，MS 和 F1的不同花药发育阶段中的绒毡层PCD，显示了在MS和F1中分别抑制和恢复的PCD，与WT相比。

在BECLIN1基因通过影响ROS（活性氧）平衡和抑制绒毡层程序性细胞死亡（PCD），导致了发育中花药中花粉粒的缺陷。特别地，MS（雄性不育）植株的花药在四分体和早期绒毡层退化阶段显示出显著降低的ROS积累，而成熟花药则展示出相较于WT（野生型）更高的H2O2水平。与MS相比，F1（MS × RS）植株在绒毡层退化和花药开裂阶段的ROS积累模式与WT类似，表明恢复的生育能力。此外，通过TUNEL检测显示，WT的花药在8-15mm花蕾阶段绒毡层细胞核展示出PCD信号，而MS花药缺乏这些信号，F1示例中的花药则显示出正常的PCD。

在温室环境下，对不同T3代RS和T4代MS线，及其F1和F2植株进行了详细的表型和生殖分析。研究发现，转基因植株与野生型相比，在早期开花阶段显示出可变的叶片数量，且在生理性状如蒸腾作用、气孔导度、光合作用和水分利用效率方面没有统计学意义上的变化。在植物发育的后期阶段，表达BECLIN1的MS线（如MS182和MS3）显示出较WT明显更高的植株高度、节位数、分枝数和茎直径，而一些RS和一种F1杂交种（MS182 × RS3）则展现出更旺盛的营养生长。关于生殖性能，F1杂交种在铃果设置方面展现出正常恢复的雄性生育能力，而MS转基因植株则由于花粉不可育展示出更多无铃果发育的花。然而，在生长季节末，雄性不育现象时而中断。此外，表达COP1L105A的RS和F1转基因体在成熟、未开和已开放的棉铃大小上，与WT相比，表现出显著增加的铃宽和长度。这些转基因体（RS，F1和F2）显示出除了RS9外，开放铃重量显著增加，而种子数量则有所差异。种子尺寸（长度和宽度）、绒毛含量和种子设置率在转基因植株中也显示出与WT相比的标准化增长。在收获时期，随机选择的植株表型（MS，RS和F1）也观察到在植株高度、分枝数、茎直径和总鲜生物量上有显著增加。

Fig5: 在受控条件下比较控制组与转基因植物不同农艺性状的对比分析。

(a-d) 分别展示控制组（WT）、雌性（MS）、雄性（RS）和F1（MS × RS）的整株植物表型。

(e-v) 包括各种表型和生殖参数：(e) 植株高度，(f) 节位数，(g) 分枝数，(h) 茎直径，(i) 花朵数量，(j) 每株棉铃数量，以及(k和l) 转基因体相较于WT的雄性不育比例和恢复生育能力。

(p-v) 在WT和表达Cop1的转基因体（RS, F1和F2）中，对50颗种子的总纤维和种子产量进行比较分析。

本研究成功展示了在棉花中应用的可逆转基因雄性不育系统，这种系统具有重要的经济意义。通过结合细胞质雄性不育（CMS）和基因雄性不育（GMS）技术，本研究的方法主要应用于中国和印度的商业棉花种植。独特的是，该系统结合了多种雄性不育基因，并无需特定的恢复基因，这一点与传统的Barnase-Barstar系统或CMS系统中的核恢复系不同。此外，该研究还通过向雌性基因盒中加入抗除草剂基因BAR，赋予植株对除草剂BASTA的耐受性，使得转基因植株在早期植物发育阶段就能通过喷施BASTA来区分雄性不育与育性植株，简化了筛选过程。在玻璃温室和网室条件下的实验验证表明，该系统在控制植株性状和生产力方面表现出高度的可控性和稳定性，特别是在植株生长、花朵发育和纤维产量方面。这种系统不仅为棉花提供了一个可靠的雄性不育和恢复机制，也为其他重要经济作物的杂交种生产提供了潜在的应用前景。并且未来可以在其他商业重要作物中使用。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14518

文章来源：植物生物技术Pbj