反向育种要是做成了，种子行业会不会乱套？

2024年10月30日 0条评论 42次阅读 0人点赞

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《反向育种要是做成了，种子行业会不会乱套？》

01
背景介绍
在进入今天的主题之前，咱们先来回忆一下减数分裂的过程（图1）：在减数第一次分裂中，染色体复制形成两条姐妹染色单体，同源染色体配对形成“四分体”结构，非姐妹染色单体形成“交叉点”发生重组，随后，同源染色体分离，细胞分裂为两个子细胞，在减数第二次分裂中，没有染色体的复制，细胞再次分裂，姐妹染色单体分离，最终形成四个配子。之后雌雄配子通过受精恢复成二倍体状态。
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图1 减数分裂过程。图片来源：bio.libretexts。

在减数分裂中，同源染色体非姐妹染色单体的重组增加了后代的遗传多样性，这对杂交育种会产生什么影响呢？这是把双刃剑，一方面，这个过程可能产生新的等位基因组合，形成优势性状消除不利性状，通过增加重组频率减少育种周期、降低获得集合优势性状品种的难度。另一方面，由于重组的频率和位置不可控，杂交作物的后代存在较多的可变性，较难保留优势表型，所以固定杂种优势就成为杂交育种需要解决的关键科学问题，除了传统方法（图2）之外，通过降低或抑制重组频率是其中的一种解决思路。
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图2 传统育种流程-从优良杂交种中开发新的自交系(Yi Xin G et al., 2015)。该流程涉及多轮自交、产量测试和组合能力选择，需要六到七年时间来固定杂种优势模式（右）。SS，硬秆；NSS，非硬秆。

无融合生殖技术和反向育种技术（Reverse breeding，RB）都是通过降低或抑制重组频率固定杂种优势的技术。它们的不同点在于无融合生殖技术是在杂交种子上想办法，而反向育种技术则是在亲本上想办法。

关于无融合生殖技术，大家可以去看看伯小远之前写的文章“杂交作物如何通过自交获得克隆种子？”。通过无融合生殖能产生与母体基因组完全相同的后代，即实现母体的克隆，因而可以固定杂交优势，免去杂交制种的繁琐步骤，是具有革命性潜力的新型育种方式。目前无融合生殖技术的思路是把杂交种子的减数分裂转变为有丝分裂（例如敲除REC8、PAIR1和OSD1基因），再消除受精的合子中来自某一方亲本的染色体（例如与CENH3突变材料杂交，或敲除MTL或DMP等基因），或者直接让未受精的配子体进行孤雌生殖（例如过表达BBM或PAR或WUS基因）（图3）。目前在拟南芥和水稻中已经实现了无融合生殖技术(Marimuthu et al., 2011; Wang et al., 2019; Khanday et al., 2019; Song et al., 2024; Huang et al., 2024)。

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图3 无融合生殖技术的两种思路：（a-c）CENH3突变植株作为母本与野生型杂交（被称为父系单倍体诱导），或者，MTL或DMP突变植株作为父本与野生型杂交（被称为母系单倍体诱导），会导致受精后来自某个亲本的基因组从合子的基因组中消除，最终产生单倍体后代；（d）通过在卵细胞中异位表达BBM或PAR或WUS基因，激活器官发生或胚胎发生途径，可直接诱导单倍体胚胎的发育。图片来源：maxapress.com。
关于无融合生殖技术这里就介绍这么多，今天的重点是给大家介绍反向育种技术（Reverse breeding，RB）。在常规育种中，由于基因重组的不可控性，导致每个后代的基因组合都是随机的，育种家需要花费大量时间去筛选具有理想性状的植株。而反向育种则是从表型优良的杂种F1代开始，通过抑制基因重组，获得含亲代染色体的配子，再将配子培养为双单倍体（DHs）植株，通过不同的组合选择染色体互补的株系重新杂交，最终获得和初始杂交种基因型一致的杂交系（图4）。目前在拟南芥中已经实现了反向育种技术(Wijnker et al., 2012)，在作物中还未见报道。从固定杂交优势这方面看，通过反向育种技术可直接生成纯合的亲本品系，后期可对亲本进行进一步的改良，这与无融合生殖固定杂交优势的思路不同。
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图4 反向育种与传统育种不同。图片来源：inspiringscience.net。
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反向育种的提出
2009年，荷兰瓦赫宁根大学Erik Wijnker团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Reverse breeding: a novel breeding approach based on engineered meiosis”的研究论文，在该论文中，作者首次提出了反向育种的概念，并详细阐述了其原理、实现步骤、优势以及应用。

依据该论文，可以总结出反向育种的步骤是：①选择具有优良性状的杂交种（F1代）。②使用技术手段抑制杂交种发生基因重组。③获得单倍体：使每一个配子含有的是未重组的单倍体。④利用双单倍体技术，将这些配子转化为纯合体。⑤从这些纯合体中筛选出与起始杂交种基因型匹配的两组纯系植物，作为新的“亲本”，通过这两组纯合亲本的再次杂交，理论上能够重现起始杂交种的优良性状（图5、图6）。
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图5 反向育种可用于固定未知的杂合⼦(Dirks et al., 2009)。将两个纯合亲本杂交产生F1代，F1代自交产生F2代，选择其中具有理想性状的植株作为起始杂交种，并对其进行反向育种（灰色框）。通过抑制减数分裂重组，亲本染色体通过配子传递但不发生重排。图中杂交种的四条染色体在配子中可产生16种组合，这里只展示了5种，之后利用体外培养技术，使用无重组配子生产DHs系，选择互补亲本即可完美重建起始杂交种。

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图6 反向育种可用来生产染色体替换系(Dirks et al., 2009)。选择F1代作为起始杂交种，在使用反向育种得到的DHs群体中，存在将其中一个起始亲本的染色体替换到另一个亲本背景中的染色体替换系。
这个过程中最重要的两个步骤：一个是抑制重组，另一个是获得单倍体。针对如何抑制重组的问题，可以考虑通过RNA干扰（RNAi）、VIGS或者嫁接等方法干扰在染色体交叉互换中发挥重要功能的基因如ASY1、PAIR2、DMC1、PTD、SPO11或SDS（图7）等来实现抑制重组的效果，也可以考虑通过外源施加能抑制减数分裂重组的化学物质如Mirin（图8）来实现(Dirks et al., 2009)。针对如何获得单倍体的问题，可以考虑通过花药培养、胚珠培养等技术实现(Dirks et al., 2009)。当然，这些都是作者的设想，后续在拟南芥中成功实现反向育种技术是不是使用了这些方法呢，这个伯小远在后面会讲到喔。
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图7 减数分裂重组及DNA修复模型(Lloyd, 2022)。DNA复制完成后，DNA环与相关蛋白一起沿着轴的方向排列成染色质环，称为牵回环-轴复合物，同时细胞程序性地诱导DNA双链断裂（DSBs），接着DNA末端被切割，单链的DNA末端结合相关的蛋白介导同源染色体的链侵入和D环的形成。这些联合分子随后通过多条平行路径被处理，形成交叉或非交叉。正文中提到的ASY1是一种轴丝蛋白，帮助同源染色体配对和轴结构的形成；PAIR2是一种轴丝相关蛋白，同样参与同源染色体的配对；DMC1重组酶催化单链DNA与其同源染色体中的互补序列进行链侵入，从而启动同源重组过程；PTD是拓扑异构酶II的伴侣蛋白，主要参与染色体的解缠过程，确保染色体在减数分裂过程中能够正确解缠和分离；SPO11是减数分裂期间引发DNA双链断裂（DSB）的关键酶；SDS调控减数分裂前期的同源配对和DNA修复过程。
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图8 Mirin（CAS号：299953-00-7）是一种有效的Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）复合物抑制剂(Dupré et al., 2008)。MRN复合物主要负责感知和处理双链断裂，并激活DNA修复信号。

另外，作者也计算了在不同物种中，使用这种方法需要的DHs的数量（表1）。

表1 在不同的物种中，以不同的概率水平重建原始杂交种所需的非重组DHs的数量(Dirks et al., 2009)。
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反向育种的成功案例
2012年，荷兰瓦赫宁根大学Erik Wijnker团队在Nature Genetics杂志上发表了一篇题为”Reverse breeding in Arabidopsis thaliana generates homozygous parental lines from aheterozygous plant”的研究论文，该研究首次在拟南芥中成功实现了反向育种技术。现在回答前文的问题，针对如何抑制重组的问题，作者使用RNAi技术干扰DMC1基因解决了这个问题(图9)，针对如何获得单倍体的问题，作者并未如前所述通过花药培养、胚珠培养等技术进行解决而是通过CENH3突变植株作为单倍体诱导系获得了单倍体。伯小远猜测可能是作者之前用组培的方法一直没有成功，而2010年发表的Nature文章”Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination”报道拟南芥CENH3单倍体诱导系给了作者启发。伯小远在“纯系养成–单倍体诱导技术(二)”中详细介绍了CENH3相关的知识，大家感兴趣的话可以去看看喔！
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图9 野生型植株和RNAi:DMC1植株中的减数分裂(Wijnker et al., 2012)。在野生型植株的减数分裂中，染色体在粗线期配对，随后在第一次减数分裂中期形成五个二价体，四分体出现四个正常的细胞核。在RNAi:DMC1植株的减数分裂中，抑制DMC1破坏了染色体在粗线期的配对，且由于第一次减数分裂中期单价体分离不平衡而形成多价体。
2014年，Erik Wijnker团队在Nature Protocols杂志上发表了题为“Hybrid recreation by reverse breeding in Arabidopsis thaliana”的拟南芥反向育种的详细实验步骤，大家感兴趣的话可以去看看喔！
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图10 反向育种流程图(Wijnker et al., 2014)。（1）选择两个带有不同染色体插入的DMC1:RNAi转基因系（星号标记）。（2）无重组亲本与第二个种群杂交，产生两个无重组的起始F1杂交种A和B，它们是同源的，除了转基因插入位点（分别在第4和第5染色体上）。（3）将杂交种A和B作为父本、GFP-tailswap（指组蛋白H3.3的N端代替CENH3的N端，并融合GFP）作为母本进行杂交，得到单倍体植株。（4）种植单倍体植物并自交以产生纯合的双单倍体后代即染色体替换系（CSLs）。（5）选择合适的CSLs进行杂交以再生起始杂交种。左边的三次杂交分别再生起始杂交种A、A和B，而第四次杂交则重新构建了一个无转基因的野生型杂交种。
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反向育种的发展
上述方法的不足是，通过RNAi技术降低DMC1的表达导致染色体的交叉互换被完全抑制了，这正是预期的。但是，交叉互换可以使染色体之间建立物理上的联系，有助于同源染色体之间紧密连接形成二价体，确保它们在减数第一次分裂中被正确地拉向相反的两端，如果不发生交叉，同源染色体无法正确配对，染色体可能会分配不均，使生成的配子染色体数目异常，进而导致配子不育。正因如此，使用RNAi抑制DMC1表达的方法限制了其在作物上的进一步应用。另一种思路是减弱而不是完全抑制重组的发生，以提高配子的可育概率。

另外，反向育种若想从自交群体开始，那么上述的方法不可行，因为其需要在第一步向亲本中转入RNAi载体以抑制重组，而自交群体不一定能找到亲本。

2020年，荷兰瓦赫宁根大学Erik Wijnker团队在The Plant Journal杂志上发表了一篇题为“Meiotic crossover reduction by virus-induced gene silencing enables the efficient generation of chromosome substitution lines and reverse breeding in Arabidopsis thaliana”的研究论文，在该研究中，作者使用VIGS介导的瞬时基因沉默技术降低了减数分裂重组酶MSH5基因的表达，暂时下调了交换重组发生的概率，并成功应用于拟南芥的反向育种中。作者最终获得了32个可能的20个染色体替换系（CSL）。该方法仅需两代就可以得到杂合F1代的亲本品系（图11），而前述RNAi介导的方法则需要五代。
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图11 通过抑制重组和产生DHs来对拟南芥进行反向育种(Calvo-Baltanas et al., 2020)。选择一个杂合子作为起始材料，这个杂合子的交换受到抑制，用其花粉为GFP-tailswap植株授粉，产生单倍体及DHs用于重建起始杂交种。

反向育种技术需要结合分子标记技术以辅助筛选。2015年，南通大学李平团队在Journal of Integrative Agriculture杂志上发表了一篇题为“Development and application of marker-assisted reverse breeding using hybrid maize germplasm”的研究论文，作者利用分子标记从一个亲本信息未知的玉米起始杂交种筛选出了与相应父本和母本高度相似的材料。由于玉米种皮基因全部来自母本，而胚的基因一半来自母本、一半来自父本，分别获取起始杂交种种皮和胚的DNA，利用高密度芯片推导出双亲的基因型，再选择均匀分布于10条染色体的192个双亲间的多态性标记构建低密度芯片用于后续的辅助筛选。作者从F2代杂交种开始，经过三轮的标记辅助筛选F3、F4和F5代，获得了与亲本基因型有80%相同的品系（图12）。该研究使用的并非是前述Erik Wijnker提出的反向育种思路，因此小远在这里并未将其列入“实现玉米反向育种技术”之列，这里是提示大家可以在反向育种的实施路径中采用此方法以提高筛选效率。

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图12 通过分子标记辅助反向育种开发的近交品系，其基因型和表型与杂交种的父母本相似(Yi-Xin G et al., 2015)。

小远叨叨

看完关于反向育种的相关资料，伯小远觉得这个技术如果做成功了，对做杂交育种的公司可能会有很大的冲击。伯小远发现反向育种似乎在十几年前研究的比较多，2012年反向育种在拟南芥中做出来之后，后面那么多年为什么没有在作物中做出来呢？伯小远觉得可能有三个原因，一个是关于作物中减数分裂的基础研究可能做的还不够成熟，二是当时的单倍体诱导技术还不够成熟，另外该方法也受物种的遗传转化限制。但现在再看这三点，基础研究发展的很迅速，减数分裂基因、单倍体诱导基因被发现的越来越多，基因编辑技术、单倍体诱导技术都在大力发展，甚至连破除遗传转化限制的HI-Edit、IMGE以及嫁接技术也有了，那么，在不久的将来反向育种会不会在作物中也实现呢？大家可以来一起讨论喔！

References：
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