PBJ | 中国农大张永亮课题组揭示RH20在RNAi介导抗病毒免疫中的新机制

植物为保护自身免受病毒攻击进化出了多种抗病毒防御途径 (Wu et al., 2024),其中最常见是RNA干扰(RNA interference, RNAi)介导的抗病毒免疫。RNAi通路的关键组分包括DCLs(Dicer-like proteins)、AGOs(Argonaute proteins)、RDR6(RNA-Dependent RNA Polymerase 6)和SGS3(Suppressor of Gene Silencing 3)等蛋白。当正义链RNA病毒基因组发生复制时产生双链RNA被植物DCLs蛋白所识别并切割成21–24 nt的小干扰RNA(siRNA),siRNA被装载到AGOs蛋白中形成RISC复合体(RNA-induced silencing complex),进而靶标病毒RNA诱发RNA沉默,siRNA进一步通过SGS3和RDR6相分离形式的小体(siRNA body)扩增出大量次级小RNA以放大RNA沉默的信号,最终实现RNA沉默介导的抗病毒防御。虽然RNAi通路中的关键组分如DCLs、AGOs及SGS3等蛋白已被广泛研究,但是否有其他蛋白参与调控RNAi仍需深入挖掘。

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2024年8月21日,中国农业大学生物学院张永亮课题组在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“DEAD-box RNA helicase RH20 positively regulates RNAi-based antiviral immunity in plants by associating with SGS3/RDR6 bodies”的研究论文。该研究以大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)编码的沉默抑制子(Viral suppressors of RNA silencing, VSR)γb蛋白为诱饵,利用邻近标记技术分析了γb的邻近蛋白互作网络,并鉴定出一个在RNAi通路中发挥作用的新组分RH20(DEAD-box RNA helicase RH20),该研究进一步肯定了利用病毒VSR解析RNAi通路的独特优势,同时也为植物抗病育种中提供了潜在的基因资源。
该研究在BSMV病毒基因组RNAγ编码的γb蛋白的C端融合了TurboID蛋白(图1),利用该载体鉴定了在病毒侵染条件下γb的邻近蛋白组,生物信息分析表明约三分之一的蛋白都和RNA加工过程相关(图1),而其中DEAD-box家族蛋白重现频率高,于是作者进一步选择了RH20蛋白进行了深入研究。
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1. BSMV侵染条件下γb蛋白的邻近标记分析和互作网络构建

RH20蛋白所在的DEAD-box家族高度保守,其在果蝇中的同源蛋白Dmp68此前被报道与RNAi途径相关,但是RH20在植物病毒侵染中的功能在很大程度上仍然未知。生物学功能分析表明RH20发挥抗BSMV的作用。RNA沉默抑制子分析和小RNA测序证明了RH20蛋白促进RNAi过程,是RNA沉默通路的正调控因子。进一步细胞生物学和生化等实验表明,RH20通过和SGS3直接互作定位到SGS3/RDR6小体中,通过增强病毒来源的小干扰RNA的产生来负调控BSMV的侵染(图2)。此外,RH20还能抑制芜菁花叶病毒(TuMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)等病毒的侵染,表明RH20在正义链RNA病毒侵染中广泛发挥作用。
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2. RH20SGS3/RDR6小体(siRNA body)互作正调控RNAi来抑制BSMV侵染

BSMV的多功能蛋白γb很早就被证明具有强烈的VSR活性 (Bragg and Jackson, 2004),然而迄今为止,γb蛋白发挥VSR功能的分子机制仍然未知。为分析γb蛋白是否会通过靶向RH20蛋白来抑制寄主RNA沉默,利用病毒突变体接种实验和竞争性互作实验,证明γb蛋白通过干扰RH20和SGS3的互作来破坏RH20的抗病毒功能。综上所述,该研究鉴定了RNAi通路的一个潜在新组分—RH20,该蛋白与SGS3互作从而正调控RNAi介导的抗病毒免疫;而BSMV编码的沉默抑制子γb竞争性地破坏RH20-SGS3的互作,从而帮助病毒实现反防御。值得一提的是,几乎在同一时期,中国科学院动物研究所张晓明研究员团队也同样发现拟南芥RH20可以促进小RNA的积累并增强植物对病毒的抗性(Huang et al., 2024)。
中国农业大学生物学院张永亮教授为该论文通讯作者,中国农业大学生物学院已毕业博士温智琰为该论文第一作者。中国农业大学李大伟教授、李溱教授、苏震教授、杨萌副教授和赵晓云实验师参与了该项工作,研究工作还得到了中国农业科学院植物保护研究所李方方研究员、中国科学院动物研究所张晓明研究员、中国科学技术大学生命科学学院吴清发教授和中国农业大学王献兵教授、于嘉林教授、韩成贵教授、王颖副教授等在内的多位老师在实验材料和技术方面的帮助和宝贵建议,该研究由国家自然科学基金和拼多多-中国农业大学研究基金等资助完成。

附:

中国农业大学张永亮课题组主要从事植物病毒致病的分子机制和宿主抗病毒免疫研究。近年来合作开发了用于植物中互作蛋白研究的邻近标记技术(Zhang et al., 2019, Nature Communications; Yang et al., 2021, Plant Communications; Zhang et al., 2020, Journal of Visualized Experiments)。在此基础上,鉴定了多个在植物病毒致病和抗病毒免疫中发挥功能的新组分(Zhang et al., 2023a, PNAS; Zhang et al., 2024, Molecular Plant; Zhang et al., 2023b, Plant Cell; Zhang et al., 2019, Nature Communications), 为深入理解植物病毒与宿主互作提供了新的科学数据,也为植物抗病毒遗传改良提供了潜在的基因资源。

参考文献

1.Bragg J.N., and Jackson A.O. (2004). The C-terminal region of the barley stripe mosaic virus γb protein participates in homologous interactions and is required for suppression of RNA silencing. Molecular Plant Pathology 5:465-481.

2.Huang J., Zhao Y., Liu S., Chen Y., Du M., Wang Q., Zhang J., Yang X., Chen J., and Zhang X. (2024). RH20, a phase-separated RNA helicase protein, facilitates plant resistance to viruses. Plant Science 347:112176.

3.Wu J., Zhang Y., Li F., Zhang X., Ye J., Wei T., Li Z., Tao X., Cui F., Wang X., et al. (2024). Plant virology in the 21st century in China: Recent advances and future directions. Journal of Integrative Plant Biology 66:579-622.

4.Yang X., Wen Z., Zhang D., Li Z., Li D., Nagalakshmi U., Dinesh-Kumar S.P., and Zhang Y. (2021). Proximity labeling: an emerging tool for probing in planta molecular interactions. Plant Communications 2:100137.

5.Zhang D., Gao Z., Zhang H., Yang Y., Yang X., Zhao X., Guo H., Nagalakshmi U., Li D., Dinesh-Kumar S.P., et al. (2023a). The MAPK-Alfin-like 7 module negatively regulates ROS scavenging genes to promote NLR-mediated immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 120:e2214750120.

6.Zhang D., Yang X., Wen Z., Li Z., Zhang X., Zhong C., She J., Zhang Q., Zhang H., Li W., et al. (2024). Proxitome profiling reveals a conserved SGT1-NSL1 signaling module that activates NLR-mediated immunity. Molecular Plant. DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2024.07.010.

7.Zhang Q., Wen Z., Zhang X., She J., Wang X., Gao Z., Wang R., Zhao X., Su Z., Li Z., et al. (2023b). RETICULON-LIKE PROTEIN B2 is a proviral factor co-opted for the biogenesis of viral replication organelles in plants. Plant Cell 35:3127-3151.

8.Zhang Y., Li Y., Yang X., Wen Z., Nagalakshmi U., and Dinesh-Kumar S.P. (2020). TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments:e60728.

9.Zhang Y., Song G., Lal N.K., Nagalakshmi U., Li Y., Zheng W., Huang P.-j., Branon T.C., Ting A.Y., Walley J.W., et al. (2019). TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications 10:3252.

文章来源:植物生物技术Pbj

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