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高效遗传转化体系的建立可以促进基因的功能研究,也可以加快作物新品种的培育。植物的再生诱导是决定遗传转化能否成功的关键环节之一,在先前的推文“显著提高遗传转化效率,只需一步!”和“显著提高遗传转化效率,只需一步!(二)”中,小远给大家介绍了很多可以提高植物再生和遗传转化效率的基因,例如,过表达WIND1可以促进拟南芥外植体的芽再生(Iwase et al., 2015);过表达BBM和WUS2,可以使许多难转化的玉米自交系获得较高的再生和遗传转化效率(Lowe et al., 2016);过表达GRF5有助于提高甜菜、油菜、大豆、向日葵、玉米和西瓜的遗传转化效率(Kong et al., 2020; Pan et al., 2021);过表达PLT5可以促进金鱼草地上茎伤口处愈伤组织的形成和芽再生、提高油菜和甜椒的芽再生效率和转化效率(Lian et al., 2022)等。近期,小远又收集了关于过表达或编辑某些基因来提高植物再生和遗传转化效率的文章,接下来和小远一起去看看吧。
GOLDEN2
虽然目前水稻的遗传转化体系较为成熟,但仍有某些籼稻和粳稻品种的遗传转化相对困难,因此开发高效的水稻遗传转化体系对于水稻的分子育种和基因功能研究具有重要的意义。
2023年1月,华南农业大学祝钦泷、郭晶心课题组在SCIENCE CHINA Life Sciences杂志上发表了一篇题为“Overexpression of maize GOLDEN2 in rice and maize calli improves regeneration by activating chloroplast development”的研究论文。该研究发现过表达玉米GOLDEN2基因可以有效地促进水稻和玉米愈伤组织的分化,提高遗传转化效率。在该研究中,作者为了开发高效的植物遗传转化体系,首先对玉米GOLDEN2(G2)基因进行水稻密码子优化合成了rZmG2基因,并从水稻中筛选到了一个愈伤组织特异性表达的启动子CSPpro,用于驱动rZmG2基因的表达。接着将构建好的双元载体分别转入籼稻(华占、华光)和粳稻(DongJing、中嘉8号)中,结果显示,阳性愈伤组织在分化阶段会提前转绿,并且rZmG2的过表达有效地提高了转基因愈伤组织的再生效率和转化效率(图1、表1)。此外,作者将构建好的双元载体转入玉米中同样观察到转化效率的提高。为了探究rZmG2促进愈伤组织再生的分子机制,作者利用转录组测序和RT-qPCR检测发现,转化rZmG2的水稻愈伤组织中许多与叶绿体发育和植物激素相关的基因表达量上调。这些结果表明,rZmG2可能通过激活叶绿体发育和植物激素途径来促进愈伤组织的分化并提高再生效率。
图1 过表达rZmG2可以促进水稻再生(Luo et al., 2023)。(A)pYLTAC380H-CSPpro::rZmG2载体的结构示意图,利用可诱导的热激启动子18.2pro驱动Cre的表达可以切除两个LoxP中间的35Spro:HPT、CSPpro:rZmG2和18.2pro:Cre表达盒,从而获得不含筛选标记和rZmG2的阳性植株;(B-E)四个品种的水稻在愈伤组织分化阶段的再生表型。
表1 水稻转化结果统计(Luo et al., 2023)。
WOX14
WOX转录因子在促进细胞分裂、维持干细胞的稳定性、胚胎的发育和形成、根与花器官的发育、形成层的分化等方面均发挥着重要的功能,因此可以作为提高植物再生效率的候选调节因子。在先前的推文中已经给大家介绍过WUS、WOX5和Wox2a在提高植物再生和遗传转化效率方面的应用,那么除此之外还有哪些WOX基因可以提高植物的再生效率呢?
2023年5月,陕西师范大学王国栋课题组和华中农业大学赵毓课题组在Plant Physiology杂志上发表了一篇题为“WUS-RELATED HOMEOBOX 14 boosts de novo plant shoot regeneration”的研究论文,揭示了拟南芥AtWOX14及其在水稻中的同源蛋白OsWOX13均可以显著地增强拟南芥和水稻的再生能力。在该研究中,作者首先通过分析拟南芥WOX14的过表达株系和突变体株系的芽再生能力,发现AtWOX14过表达株系与对照组相比表现出更高的芽再生能力,相反wox14突变体的芽再生能力受到限制(图2A)。接着,为了进一步探究过表达AtWOX14的愈伤组织能否在不含细胞分裂素的芽诱导培养基(SIM)上再生出芽,作者将WT和35S:WOX14愈伤组织从愈伤组织诱导培养基(CIM)上转移至不含细胞分裂素的SIM中,结果显示35S:WOX14愈伤组织仍可以正常再生出芽(图2B)。这一结果表明,AtWOX14过表达可能是通过影响细胞分裂素信号传导来触发芽从头再生。最后作者还利用GUS和YFP报告基因检测了拟南芥愈伤组织中AtWOX14的表达,结果显示AtWOX14在CIM培养基上被强烈诱导,而转移至SIM上后在愈伤组织细胞中表达大幅下降(图2C),这表明AtWOX14的表达仅限于愈伤组织创始细胞。为了确认AtWOX14提高植物再生能力的普遍性,作者在水稻中过表达AtWOX14后发现同样可以提高水稻的再生效率,且不影响水稻的育性。随后,作者发现水稻中AtWOX14的同源蛋白OsWOX13也具有提高水稻再生效率的功能(图3)。
图2 AtWOX14显著提高了拟南芥的芽再生能力(Wang et al., 2023)。(A)WT、wox14-1和35S:WOX14的芽再生表型;(B)在不添加细胞分裂素的情况下,比较WT和35S:WOX14外植体的芽再生能力;(C)在CIM和SIM上培养的愈伤组织中AtWOX14的表达情况。
图3 AtWOX14及其同源蛋白OsWOX13均能促进水稻的芽再生能力(Wang et al., 2023)。
TaLAX1
近些年,虽然小麦遗传转化技术取得了巨大的进展,但是对于一些再生效率低的小麦品种来说,其遗传转化仍然受限。以往的研究表明过表达GRF4–GIF1、TaWOX5、TaDOF3.4和TaDOF5.6能够显著提高小麦的再生和遗传转化效率(Wang et al., 2022; Liu et al., 2023)。那么是否还有其他基因可以提高小麦的遗传转化效率呢?
2023年10月,山东农业大学苏英华、张宪省课题组在Plant Communications杂志上发表了一篇题为“Enhancing wheat regeneration and genetic transformation through overexpression of TaLAX1”的研究文章。该研究发现,对于部分小麦品种,过表达TaLAX PANICLE1(TaLAX1)基因能够显著提高其再生效率、遗传转化效率和基因编辑效率。作者首先通过RNA原位杂交技术发现TaLAX1可能具有促进分生组织细胞增殖的作用。接下来,为了阐明TaLAX1的具体功能,作者将TaLAX1-A、TaLAX1-B和TaLAX1-D分别构建到PC186表达载体中进行遗传转化,结果显示,在整个转化过程中,小麦Fielder的芽再生效率均显著增强,其中TaLAX1-A在再生的各个阶段均表现出最高的再生效率(图4)。
图4 过表达TaLAX1可以促进Fielder的芽再生(Yu et al., 2023)。(A)PC186-TaLAX1–myc载体的结构示意图,PC186空载体用作对照;(B)对照组和实验组的芽再生表型;(C)愈伤组织再生效率;(D)芽再生效率;(E)愈伤组织的增殖效率。
为了进一步探究TaLAX1-A对小麦转化过程中芽再生的影响,作者将TaLAX1-A过表达载体转入其他7个小麦品种中,其中包括一些已知的难转化品种。通过观察发现,这些小麦的转基因愈伤组织的再生效率、芽再生效率和愈伤组织增殖效率相比于对照组均显著提高(图5),这说明过表达TaLAX1-A可以有效地提高小麦的再生效率。随后,作者还评估了TaLAX1-A对小麦遗传转化和基因编辑效率的影响,结果显示,过表达TaLAX1-A可以有效地提高小麦的遗传转化和基因编辑效率(图6)。基于以上结果,作者进一步探究了TaLAX1-A在小麦再生过程中的分子机制,RNA-seq、ChIP-qPCR和Dual-LUC等实验表明,TaLAX1-A可以激活TaGRF4-A和TaGIF1-A的表达,并且能够增强细胞分裂素的积累和生长素响应,从而提高小麦转化过程中的再生效率。最后,作者还分析了玉米和大豆中TaLAX1同源基因的功能,在玉米B104中过表达ZmBA1可以显著提高再生效率,在大豆东农50中过表达GmLAX1同样可以提高再生效率(图7)。
图5 过表达TaLAX1–A可以促进不同品种小麦的芽再生(Yu et al., 2023)。(A)不同品种小麦的对照组和实验组的芽再生表型;(B)愈伤组织的增殖效率;(C)愈伤组织再生效率;(D)芽再生效率。
图6 过表达TaLAX1-A可以提高小麦Fielder的转化和基因编辑效率(Yu et al., 2023)。(A)用含有Ubipro:GUS或TaLAX1-A-OE-GUS载体的农杆菌侵染小麦幼胚后,幼胚的芽再生和转化表型;(B)含有GUS或TaLAX1-A-OE-GUS的小麦幼胚的再生效率和转化效率;(C)gRNAs靶向的Q基因区域;(D)用含有Q-CRISPR或TaLAX1-A-OE-Q-CRISPR载体的农杆菌侵染小麦幼胚后的芽再生表型;(E)含有Q-CRISPR或TaLAX1-A-OE-Q-CRISPR的小麦幼胚的再生效率、编辑效率和Q基因被编辑的T0芽的频率;(F)被编辑的小麦中Q基因靶标1和靶标2的编辑情况;(G)编辑后的T0植株显示出每个小穗小花数量的增加。
图7 在玉米和大豆中分别过表达ZmBA1和GmLAX1可以提高转化过程中的再生效率(Yu et al., 2023)。
MdAIL5
芽再生效率低是限制苹果遗传转化的主要因素,这也在很大程度上影响了苹果的功能基因研究和性状改良。在先前的推文中,小远给大家介绍了过表达MdBBM1可以显著提高苹果的转化和再生效率,并产生健康的转基因植物用于再转化研究(Chen et al., 2022)。
2023年10月,中国农业科学院果树研究所张彩霞、韩晓蕾课题组在Horticulture Research杂志上发表了一篇题为“MdAIL5 overexpression promotes apple adventitious shoot regeneration by regulating hormone signaling and activating the expression of shoot development-related genes”的研究论文,该研究解析了MdAIL5转录因子促进苹果叶片芽再生的调控网络,表明过表达MdAIL5有利于提高苹果叶片的芽再生效率和遗传转化效率。
在前期的研究中,作者通过分析苹果不定芽再生过程中AIL转录因子家族成员的表达情况,发现AINTEGUMENTA-LIKE 5(AIL5)的上调最为显著,超过了BBM1(BBM也属于AIL转录因子家族)(Han et al., 2022)。在本研究中,作者在同一种再生培养基上对4个主要的苹果品种和7个苹果砧木的叶片芽再生能力进行检测,结果显示MdAIL5的表达水平与不同苹果基因型的再生能力呈正相关,因此推测MdAIL5在苹果芽再生中起着至关重要的作用。为了验证此假设,作者利用农杆菌介导法获得了7个MdAIL5-OE株系,通过检测叶片的再生能力,发现过表达MdAIL5的确可以显著提高苹果叶片芽再生效率(图8)。除了基因型外,叶片外植体的成熟度也是影响苹果芽再生的因素(Chugh et al., 2009),在本研究中,作者还发现通过过表达MdAIL5可增强高成熟度叶片的再生能力(图9)。为了进一步解析MdAIL5调控叶片芽再生的分子机制,作者通过LC-MS/MS和转录组测序,发现MdAIL5的过表达改变了激素和芽发育相关基因的表达水平。进一步利用Y1H、Dual-LUC和EMSA实验分析表明MdAIL5可以直接与MdARF9和MdHB14的启动子结合并激活其表达。为了分析MdARF9和MdHB14在芽再生过程中的作用,作者在烟草中分别过表达了这两个基因,结果显示MdARF9-OE和MdHB14-OE株系叶片的芽再生能力显著提升(图10)。
图8 过表达MdAIL5增强了苹果叶片的芽再生能力(Liu et al., 2023)。(a)MdAIL5-OE株系和WT中MdAIL5的表达水平;(b)MdAIL5-OE株系和WT的芽再生效率统计;(c)与野生型相比,MdAIL5-OE株系叶片在再生培养基上的表型。
图9 过表达MdAIL5可增强高成熟度叶片的再生能力(Liu et al., 2023)。(a)不同继代天数下MdAIL5-OE株系和WT叶片的芽再生表型;(b)不同继代天数下MdAIL5-OE株系和WT的芽再生效率统计。
2023年1月,中国农业大学韩振海、李威课题组在Plant Physiology杂志上发表了一篇题为“Genome editing of apple SQUAMOSA PROMOTER BINDNG PROTEIN-LIKE 6 enhances adventitious shoot regeneration”的研究论文。该研究报道了利用基因编辑技术突变苹果MdSPL6基因后,可以显著提高苹果不定芽的再生效率。GL-3是从Royal Gala(皇家嘎拉)幼苗中筛选出来的具有高再生能力的基因型。在该研究中,作者以GL-3为研究对象,通过比较分析GL-3和Royal Gala的转录组和小RNAs的结果,发现mdm-miR156aa(microRNA156aa)的高表达是GL-3再生能力强的主要原因。已有的研究报道表明miR156的靶标是SPL转录因子(Gandikota et al., 2007),因此作者推测可将SPL用作增强芽再生能力的编辑靶标。通过加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis, WGCNA),作者筛选到了一个关键基因MdSPL6,将其在烟草中过表达后发现该基因会抑制烟草的再生效率。随后作者利用Dual-LUC实验进一步证实了mdm-miR156aa和MdSPL6之间的靶向关系。综合以上结果,作者认为MdSPL6可以作为提高苹果再生效率的靶标。利用基因编辑技术获得Mdspl6突变株系后,经检测,结果证实突变体株系的芽再生能力显著提高(图11)。
小远叨叨
文章至此就告一段落了!本次推文主要是在“显著提高遗传转化效率,只需一步”和“显著提高遗传转化效率,只需一步!(二)”的基础上,又给大家介绍了几种通过过表达或编辑某个基因来提高水稻、玉米、拟南芥、小麦、大豆和苹果等植物的再生和遗传转化效率的方法,当然,没总结到的内容也欢迎大家一起来补充。另外,我司可以为大家提供小麦、玉米、大豆、水稻等二十五大物种的遗传转化服务,有需要的小伙伴可以查询我司官网或致电详询哦!
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