变废为宝——植物circRNA的研究思路总结

2024年7月11日 0条评论 174次阅读 0人点赞

本文内容速览：

经过长久的科研积淀，编码基因的结构和功能如何研究已然形成了一套系统的研究方案。近年来，随着生物技术的不断发展，非编码RNA逐渐成为植物基因功能研究中的新星。与mRNA、tRNA、miRNA等线性RNA不同，环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一类新的存在调控功能的非编码RNA，它是由外显子、内含子及基因间区域的反向剪接产生，具有闭合的环状结构，无3′端和5′端，因此其在细胞内具有更高的稳定性。circRNA广泛存在于真核生物的转录组中，研究表明其序列保守性高、在细胞组织中特异性表达，在调控基因表达、调节植物生长发育过程中发挥重要作用。

circRNA的背景介绍

早在2021年，小远就在“privilege！circRNA的高傲在哪？”中介绍了circRNA的研究历程、背景等内容，在此就不过多赘述。

01

circRNA的分类及生物发生机制

circRNA不仅存在于核DNA上，同时还存在于叶绿体DNA和线粒体DNA上(Chu et al., 2022)。对于位于核DNA上的circRNA，主要包括直接反向剪接（Direct backsplice）和套索前体（Lariat precursor）驱动环化两种形成方式（图1A、B）；对于位于叶绿体和线粒体DNA上的circRNA主要是通过核酸酶自剪切形成（图1C）。由上述三种发生方式产生的circRNA，根据其衍生的基因组的位置主要可分为外显子circRNA（EcircRNAs）、外显子-内含子circRNA（EiciRNAs）和环状内含子RNA（ciRNAs）(Zhang Pei and Dai Mingqiu, 2022)。根据剪接位点的位置又可以分为10种类型的circRNA，具体类型见图2。

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图1 植物circRNA生物发生模型(Liu et al., 2023)。（A）植物中EcircRNA的生物发生可能受侧翼内含子中存在的反向互补序列、RNA结合蛋白（RBP）、外显子跳跃事件、N6-甲基腺苷（m6A）修饰或侧翼内含子中的DNA甲基化调节。RNA解旋酶可能抑制碱基互补配对，抑制植物中EcircRNA的生物发生；（B）ciRNA来源于经典剪接事件产生的lariat RNA。RNA脱支酶1（DBR1）促进lariat RNA的降解并抑制ciRNA的产生；（C）线粒体编码的circRNA（mcircRNA）可能由前体和成熟RNA的降解产生。线粒体RNA通过核酸内切酶和3′-5’核酸外切酶的配位降解，随机产生不同类型的RNA降解中间体。这些RNA降解中间体通过未知机制环化形成mcircRNA。

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图2 circRNA的类型(改编自常珍珍等, 2022)。1：e-circRNA，两个反剪接位点均位于外显子；2：ei-circRNA，一个反剪接位点在外显子，另一个在内含子；3: i-circRNA，一两个反剪接位点都在一个内含子上；4：ie-circRNA，两个反向剪接位点位于一个或多个外显子的两个不同的内含子上；5：u-circRNA，两个反剪接位点均位于UTR；6：ue-circRNA，一个反剪接位点在UTR，另一个在外显子；7：ui-circRNA，一个反剪接位点在UTR，另一个在内含子；8：ig-circRNA，两个反剪接位点都在一个基因间区；9：igg-circRNA，一个反剪接位点在基因间区，另一个在基因区；10：ag-circRNA，两个反向剪接位点在两个不同的基因上。橙色、浅橙色和空白条分别代表外显子、内含子和UTR，绿线表示基因组的基因间区域。

02

circRNA的命名规范

同一个基因产生多个circRNA，因此简单的利用“circ”加基因名的命名方式并不准确。2023年1月，中国科学院北京生命科学研究所赵方庆课题组在Nature cell biology杂志上发表了一篇题为“A guide to naming eukaryotic circular RNAs”的评论，统一了circRNA命名方式，可有效区分相同基因位置的不同circRNA转录本（图3）。在“circ”加基因名命名的基础上，加外显子信息，以区分来源于同一个基因但由不同外显子组成的circRNA（图3a）。对于circRNA内部存在的其它可变剪接形式加入特定字符RI（retained intron）、S（short）或L（long），明确内部可变剪接产生的内含子或外显子信息（图3b-d）。对于现有基因注释中不存在的外显子的circRNA使用NE（New exon）作为占位符以示区分（图3e、f）。对于来源于不同基因的circRNA，在两个融合基因之间以“::”标注，并加入所含外显子的序号信息（图3g）。

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图3 circRNA的命名规范(Chen et al., 2023)。蓝色、灰色、粉色和绿色条代表外显子；黑线表示内含子。//：典型剪接，弧线：BSJ。

03

植物circRNA的鉴定方法

检索circRNA数据库

随着高通量测序技术的不断发展，大量的植物circRNA已经被鉴定，一系列可视化的circRNA数据库也已经建立。这些数据库包含了植物circRNA的序列、功能预测和注释等信息（表1）。

表1 植物circRNA数据库。

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利用circRNA预测工具

除了上述列举的数据库可以帮助大家搜索circRNA的相关信息外，也可以先利用相关的预测工具进行预测（表2）。其中CircPlant基于植物特有的标准从转录组数据中准确地检测植物circRNA并预测其功能(Zhang et al., 2020)；MeCi基于植物线粒体基因组的共同特征对线粒体基因产生的circRNA进行预测(Liao et al., 2022)。不同的预测工具可能侧重点有所不同，因此在进行circRNA预测时，建议同时选取多个预测工具。

表2 circRNA的预测工具。

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利用分子生物学技术

Northern blot是鉴定和验证circRNA的金标准，它使用一种与反向剪接位点（BSJ）重叠的探针或一种通用探针，结合核糖核酸酶R（RNase R）酶切，从而区分出来自同一基因的circRNA和线性RNA，不包括逆转录和扩增步骤（图4a）。然而Northern blot需要大量的RNA，耗时较长且经常使用放射性标记探针，因此在植物中验证circRNA时，反转录PCR（RT-PCR）为首要选择（图4b）。

反转录定量PCR（RT-qPCR）和微滴式数字PCR（ddPCR）可用于鉴定差异表达的circRNA。前者通过双链DNA上插入的荧光染料或覆盖在BSJ上的荧光标记探针实时检测PCR产物的扩增；后者则通过计算阳性液滴和阴性液滴的比例来确定circRNA的表达情况（图4c、d）。NanoString Technologies的nCounter平台通过生物素标记的捕获探针和携带荧光barcode的报告探针，特异性的靶向BSJ，可以同时实现多个circRNA的鉴定和定量（图4e）。原位杂交（In situ hybridization，ISH）技术使用寡核苷酸探针偶联碱性磷酸酶、荧光染料或抗原，从而使细胞中的circRNA呈现可视化（图4f）。

图4 用于检测和量化circRNA的方法(Kristensen et al., 2019)。（a）Northern blotting方法鉴定circRNA。探针可以针对基因的环形和线性转录本（左）或特异性识BSJ（右）;（b）RT-PCR利用发散引物对，在PCR过程中只扩增circRNA，PCR产物通过凝胶电泳或测序进行分析；（c）RT-qPCR利用不同的引物对来量化circRNA。D：荧光染料，F：荧光标签，Q：淬灭剂；（d）ddPCR用于circRNA的绝对定量，它基于液滴中单分子的qPCR，随后根据荧光信号对其进行分析和评分为阳性或阴性；（e）探针跨越感兴趣的circRNA的BSJ，当以相反的方向与相应的线性转录本结合时不产生信号。隔夜杂交后，清洗，使用链霉亲和素固定生物素化捕获探针，对准探针-靶标复合物，并在nCounter平台上对杂交到探针上的circRNA进行计数；（f）原位杂交对circRNA进行定量，同时还可以观察circRNA的亚细胞定位。

circRNA在植物中的作用机制

从错误的剪接产物到炙手可热的研究新星，circRNA的功能不断被挖掘，在植物的生长发育、应对生物和非生物胁迫等过程中发挥重要作用。下面跟着小远一起看看，它是如何在植物中发挥作用的吧

01

形成R-loop调控亲本基因的表达

DNA：RNA杂交体和相关的单链DNA形成内源性三链核酸结构，称为R-loop。circRNA通过与亲本基因的基因组序列的碱基互补配对形成R-loop，从而调控亲本基因的表达。

2021年5月，福建农林大学顾连峰课题组在Journal of Integrative Plant Biology杂志上发表了一篇题为“Genome-wide profiling of circular RNAs, alternative splicing, and R-loops in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa”的研究论文，作者为了研究circRNA在调节选择性剪接（AS）中的作用，首先对毛果杨的茎分化木质部（SDX）中circRNA进行了测序分析，共鉴定出2742种不同的circRNA，其中包括参与纤维素和半纤维素合成基因产生的circ-CESA4、circ-IRX7和circ-GUX1。随后通过PacBio单分子实时长读异构体测序（PacBio SMRT Iso-Seq）检测到7836个AS事件，同时鉴定了634个circRNA与699个AS事件重叠；通过DNA：RNA杂交免疫沉淀测序（DRIP-seq）技术检测到8932个R-loop与181个circRNA和672个AS事件重叠，其中包括与SDX相关的circRNA与R-loop的重叠，这表明circRNA可能在SDX中通过形成R-loop调节AS事件，从而调控亲本基因的表达（图5A-C）。随后作者构建circ-IRX7和circ-GUX1过表达载体，并将其转入原生质体中，通过DRIP-qPCR检测R-loop的含量、半定量PCR检测circRNA和亲本基因的表达水平（图5D-H）。结果表明，过表达circ-IRX7和circ-GUX1提高了R-loop的含量，抑制了亲本基因的表达。

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图5 circRNA通过形成R-loop调控亲本基因的表达(Liu et al., 2021)。（A）ciRNAs和AS事件之间的重叠。蓝色点和绿色点分别表示与AS事件重叠的ciRNAs和circRNA的数量。A3SS：3’剪接位点，A5SS：5’剪接位点，IR：内含子保，ES：外显子跳跃；（B）从外环到内环染色体、AS、circRNA和R-loop的热图。中间的彩色线表示R-loop和circRNA之间的互补区域。红色和蓝色分别表示有和没有AS事件的重叠。热图还显示了几个半纤维素和纤维素相关的基因；（C）产生circRNA的基因的GO分析；（D）过表达GFP的载体构建示意图（左）和细胞壁消化酶溶液中脱落的茎及原生质体形态；（E、G）基因结构可视化图，分别代表linear‐IRX7和circ‐IRX7（E），linear‐GUX1和circ‐GUX1（G）。聚合引物（红色箭头对）用于扩增基因组DNA，包括侧翼内含子序列。分别使用发散引物（黑色背对背三角形对）和收敛引物（白色对立三角形对）扩增circRNA和线性RNA；（F）GFP-circ-IRX7过表达载体的构建，该载体通过反向剪接Potri.009G006500的第二外显子生成。将带有内含子序列的整个外显子2插入到包含两个独立CaMV 35S启动子的瞬时表达载体中，其中一个用于过表达circ-IRX7，另一个用于表达GFP。左图显示了基于DRIP-qPCR方法检测R-loop的含量，右图显示了SDX原生质体中circRNA和线性RNA的半定量结果；（H）GFP‐circ‐GUX1过表达载体的构建、R-loop和circRNA和线性RNA的半定量结果。

02

作为microRNA的sponge或诱饵

circRNA的环状结构使其比mRNA的结构更为稳定，因此可以与mRNA竞争性的结合microRNA，降低microRNA与mRNA结合的比例，从而调节mRNA的表达量，这一作用机制为竞争性内源RNA（ceRNA），经这一机制可形成circRNA-microRNA-mRNA调控网络。2023年6月，墨尔本大学Prem L Bhalla课题组在BMC Plant Biology杂志上发表了一篇题为“Circular RNAs modulate the floral fate acquisition in soybean shoot apical meristem”的研究论文，为了研究circRNA在大豆花发育过程中的作用，作者利用短日照周期处理大豆植株，随后采取枝条的顶端分生组织（SAM）进行circRNA的测序分析，同时预测了差异表达明显的circRNA上的microRNA结合位点，发现都具有microRNA结合位点，表明circRNA可通过竞争性的结合microRNA从而调节花发育相关基因的表达。随后作者研究了与花发育相关的miR172和miR156与circRNA之间的关系，发现Circ-CCR2在短日处理植物中的表达下调，靶向miR172，从而导致其靶基因的表达量下调，最终导致开花位点相关基因（FT）的上调（图6）。

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图6 circRNAs与miR172和miR156的相互作用，以及大豆芽顶端分生组织中的激素信号通路(Babaei et al., 2023)。在花发育过程中，circ-CCR2表达下调增加了miR172与靶基因结合的比例，导致AP2和TOE1表达量下调以及FT的上调。miR156的circRNA的上调，例如circ-SEC5A和circ-EF1B，会降低该miRNA的与靶基因结合的比例，导致SPL和PFT1的表达量上调，从而促进FT的表达。红色箭头表示特定circRNA的上调或下调。虚线箭头表示circRNAs与激素信号传导和开花基因的可能存在相互作用。

03

作为蛋白质的sponge或诱饵

circRNA除了可以作为microRNA的sponge或诱饵外，同时也被证明可以与RNA结合蛋白（RBP）互作，作为蛋白质的sponge或者诱饵。2023年8月，福建农林大学顾连峰课题组在Genomics Proteomics Bioinformatics杂志上发表了一篇题为“Multi-omics of Circular RNAs and Their Responses to Hormones in Moso Bamboo (Phyllostachys edulis)”的研究论文，为了探索RBP是否参与调控circRNA，作者选定了一个与579个ecircRNA和423个ciRNA的表达呈负相关或正相关蛋白质PedQKI，其含有一个与RNA结合的KH结构域。通过RNAi技术沉默PedQKI，并瞬时转化至水稻中。随后在PedQKI沉默的水稻中检测circ-ARF17、circ-WRKY40、circ-VCL1和circ-MTR4的表达量，发现表达量均降低，表明RBP和circRNA之间存在一定的互作关系，即circRNA可以作为蛋白质的sponge或诱饵在植物体内发挥功能。

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图7 PedQKI调控circRNA的表达(Wang et al., 2023)。

04

作为翻译模板

由于circRNA缺乏5’端的帽子结构，因此常被认为不能被翻译成蛋白。然而已有的研究数据表明，circRNA可以通过内部核糖体进入位点（IRES）和m6A修饰招募翻译起始因子的方式不依赖5’端的帽子结构翻译成蛋白质(Pamudurti et al., 2017)。2022年3月，华南农业大学张亚锋老师课题组在Plant Physiology杂志上发表了一篇题为“Mitochondrion-encoded circular RNAs are widespread and translatable in plants”的研究论文。作者根据线粒体基因组的特征自主开发出了mcircRNA的算法工具——MeCi结合circRNA-seq发现玉米和拟南芥中的部分mcircRNA序列具有亲本基因的5′ UTR和CDS序列，并且从线粒体中分离的多聚核糖体中鉴定到mcircRNA，这表明mcircRNA可通过结合核糖体从而翻译成蛋白。随后作者比较了拟南芥、玉米线粒体蛋白质组数据和mcircRNA衍生的蛋白质组数据，筛选出了430个特异性跨剪接位点的肽并将它们与NCBI中的“高通量基因组序列”数据库进行匹配，tblastn结果表明，它们都无法从核基因组中预测。因此，作者使用这些肽来确定翻译的mcircRNA，分别从玉米和拟南芥中鉴定出201和157个翻译mcircRNA（图8）。

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图8 蛋白质组学数据中鉴定翻译的mcircRNA(Liao et al., 2022)。（A）翻译mcircRNA鉴定的工作流程；（B）基于特异性的跨剪接位点的肽的mcircRNA衍生蛋白鉴定的例子。圆形连接点上游和下游的氨基酸序列分别用红色和蓝色字母表示，环形连接点用黑色箭头表示；（C）通过Maxquant软件蛋白质组学数据中鉴定的翻译mcircRNAs分类。

综上，根据近几年的文献报道，circRNA在植物体内一般是通过以上四种方式发挥作用，但由于在植物体内研究circRNA相关作用机制的文章较少，大多数都集中在发现和鉴定上，因此可能并不是很全面。如果有小伙伴发现小远没有讲到的方面，欢迎一起交流哦。

了解了机制后，想必大家更关心如何通过现有的分子生物学技术研究circRNA以及一个基本的研究思路。跟着小远一起看看吧~

circRNA的研究方法和思路

通常情况下，在开展circRNA的相关研究前，可以通过circRNA-seq等高通量测序技术和相关的数据库、鉴定工具来分析不同样本间的差异表达的circRNA，随后可以通过Northern blot、RT-PCR和RT-qPCR等技术对筛选到的差异circRNA进行验证和定量，同时还能通过FISH实验来观察circRNA的亚细胞定位。随后我们可以对circRNA进行过表达、干扰和敲除，从而验证其功能。需要注意的是与常见编码基因和线性RNA不同，在构建circRNA过表达载体时需要在circRNA序列的上下游分别增加一段反向互补的序列，从而促使成环；在构建干扰载体时，也是利用siRNA和shRNA，但需要注意其干扰靶点最好设计在BSJ处，以保证干扰载体的特异性；而构建敲除载体时除了利用CRISPR-Cas9编辑系统，还可以利用CRISPR-Cas13碱基编辑系统，它通过BSJ接头的序列来识别circRNA，更有特异地区分circRNA和mRNA(Li et al., 2021)。

随后如果研究的circRNA有编码蛋白质的功能，那么可以研究其编码的蛋白质的功能。还可以通过数据库预测其可能结合的microRNA，并通过双荧光素酶报告基因实验来验证二者之间的互作，也可以更进一步的去研究microRNA的靶基因，最终形成circRNA-microRNA-mRNA的调控网路。下面一起通过一篇文献加深理解吧~

2023年1月，安徽农业大学夏恩华课题组在International Journal of Molecular Sciences杂志上发表了一篇题为“Evolutionary Landscape of Tea Circular RNAs and Its Contribution to Chilling Tolerance of Tea Plant”的研究论文，揭示了circRNA在茶树应对低温胁迫中的重要作用。作者通过circRNA-seq测序和CIRIquant、 Find_circ工具分析低温处理后茶树中的circRNA，去除序列长度大于10kb的circRNA后，共鉴定到2902个高置信度的circRNA；通过RT-PCR、Sanger测序随机对circRNA进行随机验证（图9）；并分析了全部circRNA的表达水平，筛选出250个差异表达的circRNA（图10A-C）。然后作者又对低温处理的茶树中mircoRNA进行测序分析，共鉴定到129个保守的microRNA，基于以上结果作者预测并构建了circRNA-microRNA-mRNA调控网络，发现差异表达的circRNA可能靶向与低温胁迫反应相关的多种已知miRNA，如miR166、miR172、miR396和miR408（图10D-F）。

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图9 茶树circRNAs的特征和序列验证(Huang et al.,2023)。（A）使用两种最先进的工具（find_circ 和 CIRIquant）鉴定茶树中的circRNA；（B）已鉴定的circRNA的四种主要类型（外显子、内含子、基因间和反义）；（C）circRNAs的长度分布;（D）收敛和发散引物的设计方法。（E）对随机选择的circRNA进行PCR扩增以进行验证。

注：反义circRNA指由与有义链DNA相反方向的转录本产生。

图10 茶树circRNA的差异表达和相互作用网络分析(Huang et al.,2023)。（A）使用RPB的circRNA表达模式（每10亿个干净读段的连接读数）；（B）茶树在冷胁迫下鉴定出差异表达的circRNA；（C）在不同比较中鉴定出的上调和下调circRNA；（D）差异表达的circRNAs的功能注释；（E）冷胁迫下茶树circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络；（F）突出显示了可能与网络中众所周知的冷相关miRNA相互作用的关键circRNA。

随后作者挑选出了一个参与脂肪酸合成、并与拟南芥FAB1同源的亲本基因CSS0010451.2产生的circRNA——CSS-circFAB1进行后续研究。通过RT-PCR、RT-qPCR、Sanger测序序列进行验证，结果表明CSS-circFAB1和CSS0010451.2在低温处理下表达量上调（图11A、B）。FISH实验显示，CSS-circFAB1主要定位于细胞质中（图11C）。为了进一步探索CSS-circFAB1在低温胁迫下的功能，采用反义寡核苷酸（AsODN）溶液来抑制CSS-circFAB1的表达，AsODN处理后，CSS-circFAB1和CSS0010451.2的表达水平在6h和12h时显着下降；然后将对照和处理样品低温处理1小时，发现，CSS-circFAB1沉默的茶树幼苗中最大光化学效率（Fv/Fm）显著降低，丙二醛（MDA）积累显著增加（图11D-H）。综上，CSS-circFAB1正向调节茶树的耐寒性。

图11 CSS-circFAB1正向调控茶树耐寒(Huang et al.,2023)。（A）通过RT-PCR和Sanger测序验证CSS-circFAB1序列;（B）RT-qPCR揭示的CSS-circFAB1和CSS0010451.2基因在冷驯化下的相对表达水平及其表达相关性。（C）CSS-circFAB1在茶树叶片中的FISH实验;（D）基于AsODN的CSS-circFAB1基因沉默示意图；（E）测定CSS-circFAB1沉默（6h和12h）和对照茶树的Fv/Fm）；（F）与对照组相比，AsODN处理6h和12h时CSS-circFAB1的相对表达水平；（G）CSS-circFAB1沉默和对照茶树的Fv/Fm值；（H）CSS-circFAB1沉默样品与对照组相比的MDA含量。

小远叨叨

在本篇文章中，小远给大家介绍了在植物中circRNA的鉴定方法、作用机制及研究思路。虽然circRNA在植物中的研究远不如常规基因成熟和深入，更多具有生物学功能的circRNA还有待被挖掘，但已有的研究证明其在植物生长发育过程中同样具有重要作用，circRNA有望成为新的生物标志物，为植物病害防控和作物育种提供新的思路。随着科学技术的进步，相信在不久的将来我们会对circRNA有一个更为全面的认知~

References：

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图文来源：伯远生物公众号

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