自水稻全基因组测序完成以来，水稻研究的一个主要目标就是对已注释的基因位点进行功能鉴定。突变体的获得是基因功能研究至关重要的环节，过去几十年中已有一些水稻突变体库为基因功能解析提供了丰富的资源，但是无论是理化诱变、T-DNA插入、还是RNAi沉默都有各自技术的局限性。近年来，CRISPR/Cas9技术已成为水稻基因功能研究和基因编辑育种的一个强大的工具，可以方便地实现在特定位点的插入和删除导致基因功能缺失。此外，利用CRISPR/Cas9文库已在水稻等作物中构建了混合型和阵列式突变体库，可以实现高通量的遗传筛选。

水稻种子具有较高的生物学和经济价值，是一种重要的农产品，为人类提供必需的热量和营养。研究种子发育对作物改良至关重要。然而，水稻种子性状受复杂的调控网络控制，难以观察，迟滞了相关研究进展。种子优势表达基因可能特异性地参与种子发育的某些关键进程，对其研究有助于聚焦种子性状、并进行特异性改良。许多种子优势基因对种子发育是必不可少的，此类基因缺陷可能产生种子致死表型。因此，利用种子优势表达基因，创建适当规模的突变体库，针对性开展种子性状研究，传统的单基因敲除方法可能具有特别优势。

近日，扬州大学刘巧泉教授团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为A CRISPR/Cas9-mediated mutant library of seed-preferred genes in rice的研究成果。该研究利用CRISPR/Cas9系统构建水稻种子优势表达基因的敲除突变体库，为水稻功能基因组学研究提供了新信息、以及为遗传育种工作提供了新资源。

通过水稻组织表达特性分析，挖掘到水稻种子优势表达基因，可能在种子发育过程中扮演重要作用。选取其中310个基因设计一对一的CRISPR/Cas9靶向gRNA，并利用遗传转化方法获得每个基因的单敲除突变体植株。T0和T1代植株测序显示CRISPR/Cas9可以高效产生靶基因的敲除突变，且严格的gRNA设计可以有效抑制脱靶效应的产生。突变体库中后代植株在水稻种子大小和形状、稻米理化品质、外观品质等多个种子性状上表现出丰富的差异表型，且未见株型和穗型差异，暗示其可有效用于水稻种子和品质相关性状的突变体筛选，进而挖掘调控水稻种子性状的重要基因。稻米垩白性状的遗传较为复杂，一般难以通过正向遗传学方法克隆相关基因。在该突变体库中产生了多个有明显垩白表型的突变体，从中已鉴定了一个垩白调控基因Chalk3。该基因是一个种子特异表达基因，可响应温度调控影响稻米垩白粒率和垩白度。因此，通过锚定组织特异性表达基因、基因家族、调控通路等潜在调控种子性状的基因， 利用CRISPR/Cas9创建适当或中等规模的突变体，进而筛选目标突变体，结合单倍型分析，挖掘有利等位变异可能是一种开展基因功能研究、靶向改良种子性状的有效策略。

图1水稻种子优势表达基因突变体库的创建有助于未知基因鉴定

扬州大学农学院青年教师赵冬生副教授、博士研究生陈思予、已毕业硕士韩阳朔为该论文的共同第一作者，水稻遗传育种团队刘巧泉教授、陈忱教授、李钱峰教授、张韬教授为论文共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省重点研发计划、江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目等的资助。

文章来源：植物生物技术Pbj