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2019年8月，中国农业大学田丰课题组在Science杂志上发表了一篇题为“Teosinte ligule allele narrows plant architecture and enhances high-density maize yields”的研究论文。该研究从玉米野生种大刍草中克隆了控制玉米紧凑株型、密植增产的关键基因，建立了玉米紧凑株型的分子调控网络。
在该研究中，作者利用玉米自交系W22与大刍草CIMMT 8759为亲本杂交衍生得到渗入系群体，对叶夹角进行QTL定位，并对位于玉米第1、2染色体上的两个主效QTL-UPA1（Upright Plant Architecture1）和UPA2进行精细定位和克隆，发现这两个QTL的潜在基因分别是brd1和ZmRAVL1（图1）。
图1 UPA2和UPA1的定位克隆(Tian et al., 2019)。（A）在玉米-大刍草BC2S3群体中进行叶夹角QTL定位。UPA2和UPA1分别是最大和第二大叶夹角QTL。（B）使用NIL群体（n=3180）对UPA2进行精细定位，将UPA2界定在240bp非编码区。（C）使用NIL群体（n=2040）对UPA1进行精细定位，将UPA1界定在223kb区域，该区域仅包含一个注释基因brd1。
研究发现，UPA2的功能差异是由于顺式调控元件中2bp核苷酸的插入/缺失引起的，该突变调控了下游9.5kb的B3转录因子ZmRAVL1的表达；UPA1的功能基因是参与油菜素内酯（BR）合成途径的基因brd1。功能分析发现，大刍草UPA2等位基因与DRL1具有更强的结合能力，DRL1可与LG1（玉米中控制叶舌的蛋白）互作并抑制LG1对ZmRAVL1的激活作用，导致下游基因brd1的表达下调，进而降低叶环处内源BR水平，影响叶耳细胞的增殖，最终导致叶夹角减小，株型趋于紧凑。
图2 在分子水平上UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759调控叶夹角的差异情况(Tian et al., 2019)。UPA2由位于ZmRAVL1上游9.5kb的2bp序列变异（TG/-）控制。含有UPA2中TG核苷酸的UPA2-NIL8759与DRL1的结合力高于UPA2-NILW22。DRL1与LG1相互作用并抑制LG1激活ZmRAVL1表达。在UPA2-NIL8759中，ZmRAVL1水平较低，进而下调brd1的表达，从而降低叶片区的内源油菜素类固醇水平，减小叶夹角。
田间实验表明，UPA2-NIL8759在密植条件下具有显著的增产效应。借助分子标记辅助选择，将UPA2的大刍草等位基因回交导入到了优良玉米杂交种农大108双亲（HuangC × Xu178）中获得了携带UPA2大刍草等位基因的改良农大108。田间密植实验显示，改良农大108在密植条件下玉米籽粒产量显著增加。这些结果说明UPA2野生等位变异在当前密植高产育种中可能具有重要的利用价值。
图3 UPA2-NIL8759和携带8759 UPA2等位基因的改良农大108在高密度种植条件下，显示出较高的产量(Tian et al., 2019)。（A-D）2017年在中国铁岭进行的不同种植密度下UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的百粒重（A）、单株粒数（B）、单株粒产量（C）和每公顷籽粒产量（D）的比较。（E、F）2017年中国三亚田间试验中不同种植密度下UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的百粒重（E）和单株粒数（F）的比较。（G、H）2018年中国三亚大田试验中改良农大108与原农大108在不同种植密度下的百粒重（G）和单株粒数（H）的比较。
另外ZmRAVL1的基因敲除材料叶夹角减小，株型紧凑，并且没有出现其他不利表型。田间实验表明，ZmRAVL1基因敲除材料在密植情况下具有显著的增产效应（图4）。
2022年3月，中国农业大学杨小红/李建生课题组和华中农业大学严建兵课题组在Science杂志上发表了一篇题为“Convergent selection of a WD40 protein that enhances grain yield in maize and rice”的研究论文。该论文发现，玉米KRN2和水稻OsKRN2受到趋同选择并通过相似的途径调控玉米和水稻的产量。
利用玉米野生种大刍草近缘且穗行数为6的MT-6材料与穗行数为16的现代栽培玉米自交系B73进行杂交，构建了一套重组自交系群体，利用该群体在2号染色体上初定位到了一个控制穗行数的主效QTL位点qKRN2（图5A），进一步的精细定位将基因锁定为KRN2（图5B-F）。
图5 qKRN2的精细定位(Chen et al., 2022)。（A）qKRN2初定位于2号染色体IDP1和IDP8标记之间。（B）qKRN2精细定位到标记IDP2和IDP5之间。（C、E）qKRN2进一步精细定位到标记IDP3和SNP1之间。（D）自交系群体中KRN的QTL的对数似然比轮廓图。（F）NIL-KRN2B73和NIL-KRN2teosinteKRN2基因结构及序列比较。
为验证KRN2的功能，利用Mu转座子插入技术创制了纯合突变体Mu-krn2（图6A、B）。通过分析发现纯合突变体Mu-krn2产生的穗比野生型多约1.8行（图6C）。这些结果表明，KRN2是qKRN2中KRN变异的关键基因，并且敲除该基因可以增加玉米的KRN。
图6 KRN2的敲除增加了KRN(Chen et al., 2022)。（A）Mu-krn2中KRN2的Mutator转座子插入位点。黑色阴影表示外显子；灰色阴影表示UTR。三角形表示Mutator插入位点。（B）WT和Mu-krn2中Mutator插入的PCR检测。（C）WT和Mu-krn2的穗表型。（D）WT和Mu-krn2之间KRN的定量分析。
KRN2编码的蛋白定位于细胞质，为了揭示KRN2蛋白的功能，利用酵母双杂筛库寻找其互作蛋白，最终筛选到DUF1644蛋白。后续通过酵母双杂实验、荧光素酶互补实验验证了KRN2蛋白与DUF1644蛋白之间的相互作用（图7A、B）。利用基因编辑技术构建了KRN2与DUF1644的单突变体与双突变体材料，发现krn2单突变体的花序分生组织变大，穗行数增加。同时还发现，虽然duf1644单突变体的花序分生组织大小和穗行数并未发生明显变化，但krn2/duf1644双突变体能够使花序分生组织和穗行数在krn2单突变体的基础上进一步增加（图7C-H）。
图7 KRN2及其相互作用蛋白DUF1644通过协同途径调节KRN(Chen et al., 2022)。（A、B）KRN2和DUF1644之间的相互作用被酵母双杂实验（A）和荧光素酶互补实验（B）证实。（C、D）利用CRISPR/Cas9技术对目的基因进行编辑。（E、F）敲除DUF1644不会改变KRN（E），而敲除KRN会增加KRN（F）。（G、H）WT、DUF1644和KRN2单敲除突变体以及双敲除突变体的穗表型及测量。
KRN2在水稻中具有同源基因OsKRN2，同时发现OsKRN2通过相似的途径调控水稻的产量。OsKRN2具有与玉米KRN2类似的在花序原基中高表达的模式，OsKRN2也能够与OsDUF1644发生相互作用。通过CRISPR/Cas9构建的oskrn2突变体表现出二级枝梗数与穗粒数增加的表型，而在OsKRN2过表达材料中出现了相反的表型。
将KRN2和OsKRN2基因编辑材料进行多年多点的测产实验，所有实验结果均表明，KRN2和OsKRN2的功能丧失之后，与对照相比能够通过增加穗行数或穗粒数分别提高大约10%的玉米产量和8%的水稻产量，同时在生育期和株型等其它农艺性状上无明显变化（图8）。
图8 田间条件下KRN2和OsKRN2基因编辑材料的产量表现(Chen et al., 2022)。（A）WT、CR-krn2-1和CR-krn2-2的植株和籽粒的形态学特征。（B）三个地点的WT、CR-krn2-1和CR-krn2-2的产量。（C）WT、CR-oskrn2-1和CR-oskrn2-2的植株、稻穗和籽粒形态学特征。（D）在一个地点进行的WT、CR-oskrn2-1和CR-oskrn2-2的籽粒产量。
2021年7月，华中农业大学赖志兵课题组在Molecular Plant杂志上发表了一篇题为“A Teosinte-derived Allele of a MYB Tranion Repressor Confers Multiple Disease Resistance in Maize”的研究论文。该研究成功地从玉米野生种大刍草中克隆了对NLB、SCR和GLS表现广谱抗病性的新基因ZmMM1，并鉴定到了一个能够增强ZmMM1蛋白翻译水平的调控序列qLMchr7 C117。
研究团队利用多重病害抗性相关的病斑表型为切入点，选取含有14%大刍草基因型的C117（抗病）和玉米自交系Mo17（感病）作为亲本进行遗传群体的构建，利用F2代完成初定位。选取位于7号染色体上，表型贡献率最高的QTL位点qLMchr7进行精细定位。利用分子标记M2和M3将qLMchr7定位到5kb的区间内，根据基因注释，在此区间只有一个候选基因，将其命名为ZmMM1，进一步的分析发现qLMchr7区段位于ZmMM1的3′ UTR区域。
图9 qLMchr7的精细定位(Wang et al., 2021)。（A）十叶期后两个亲本自交系（Mo17和C117）DAB染色前后的病斑表型。（B）精细定位将qLMchr7限定在距离ZmMM1基因1kb的区域。（C）在1kb的qLMchr7区域，Mo17和C117之间发现了20个SNP和7个Indels。该特定区域含有SNP443、SNP459和Indel462。
通过遗传学分析发现，ZmMM1基因正向调控玉米对NLB、SCR和GLS的广谱抗病性；而且，ZmMM1的大刍草基因型材料（qLMchr7-NILC117）比其玉米自交系Mo17的基因型（qLMchr7-NILMo17）材料更抗病。
图10 ZmMM1正向调节玉米对NLB、GLS和SCR的抗性(Wang et al., 2021)。（A、B、E）WT和突变体zmmm1-1对NLB、GLS及SCR的病害表型。WT植株和zmmm1-1突变株是从zmmm1-1突变体×B73 F2群体中分离出来的。（C、D、F）WT和突变体zmmm1-1的NLB、GLS及SCR病斑宽度。（G、I、K）近等基因系（qLMchr7-NILC117和qLMchr7-NILMo17）对NLB、GLS及SCR的抗病表型。（H、J、L）近等基因系（qLMchr7-NILC117和qLMchr7-NILMo17）对NLB、GLS及SCR的病害评分。
该研究后续通过一系列分子实验提出了ZmMM1对多种病害（NLB、GLS和SCR）的抗性功能模型。如图11所示，ZmMT3作为ZmMM1直接靶向的基因，编码一个lncRNA，在病原体感染过程中负调控ROS的积累，从而增强对多种疾病的抗性。ZmMM1 mRNA的3′ UTR上转录的qLMchr7区域调控了ZmMM1基因的翻译水平。
尽管在qLMchr7-NILC117和qLMchr7-NILMo17植株之间的ZmMM1转录水平没有差异，但qLMchr7C117的自然变异使得qLMchr7-NILC117植株中的ZmMM1蛋白水平高于qLMchr7-NILMo17植株，对ZmMT3具有更强的转录抑制能力，导致ROS水平增强，解释了它们对NLB、GLS和SCR更强的抗性。
2024年3月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿课题组联合上海师范大学王文琴课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“An ARF gene mutation creates flint kernel architecture in dent maize”的研究论文。该研究首次成功克隆了将马齿玉米转变为硬粒型玉米的关键基因Fka1（ARFTF17）。
研究团队利用EMS来诱变马齿型玉米自交系B73来筛选硬粒型籽粒表型，在M3代获得了一份硬粒型且百粒重不变的材料，命名为fka1-1。为了克隆导致fka1-1突变的基因，利用该突变体材料与野生型B73创建了一个F2群体，根据后代分离比确认突变体表型是由一个单隐性基因控制的（图12a）。基于植株穗型收集叶片DNA样本进行BSA测序，结果显示在5号染色体上有一个跨越2Mb区域（27-29Mb）的单峰（图12b-d）。基于B73基因组注释，在此区域鉴定出38个蛋白编码基因，其中只有Zm00001d014013（ARFTF17）具有单核苷酸多态性，这个多态性位于该基因的第一个外显子中，由C突变为了T（图12e）。ARFTF17基因编码ARF转录因子，在玉米种皮中高表达，随后经过遗传验证得出其突变是导致fka1-1表型变化的原因（图12f）。
图12 通过BSA克隆fka1-1和fka1-1的基因验证(Wang et al., 2024)。（a）构建fka1-1遗传群体的过程示意图。（b-d）对fka1-1进行图位克隆。（e）fka1-1的测序图谱分析显示，在ARFTF17基因的第一个外显子中发现了一个C到T的突变。（f）fka1-1与其他等位基因互补及ARFTF17Pro：FLAG-ARFTF17的遗传验证。
通过不同发育时期的RNA-seq数据和代谢组数据分析发现ARFTF17调控类黄酮的生物合成。ARFTF17通过与MYB40相互作用，抑制了MYB40对下游基因的调控功能，其中MYB40具有抑制PIN1表达和激活类黄酮生物合成基因的双重功能。ARFTF17突变或MYB40过表达会降低PIN1的表达并促进类黄酮生物合成进而减少种皮中生长素的含量，从而导致种皮变短形成硬粒粒型。
图13 ARFTF17-MYB40模块调节玉米种皮发育活性的模型(Wang et al., 2024)。
为了评估fka1表型在其他马齿型遗传背景材料中的表现，将fka1-1与20个马齿自交系（目前广泛种植的玉米杂交种特性）杂交，并观察fka1-1纯合的F2植株的穗部表型。其中18个品系具有完整的fka1表型，而只有两个品系（PHR55和LH93）表现出部分fka1表型（图14a）。这一结果证实了利用fka1改良玉米籽粒结构的广泛价值。
图14 fka1-1在不同的马齿型玉米遗传背景中表现出来的类似硬粒玉米的籽粒表型(Wang et al., 2024)。
References：
