蛋白质翻译后修饰——糖基化

2024年3月13日 0条评论 926次阅读 1人点赞

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《蛋白质翻译后修饰——糖基化》

蛋白质翻译后修饰是指在蛋白质氨基酸残基上添加或者移除特定的基团，这种修饰可以改变蛋白质的结构、稳定性和生物活性，在调控细胞信号转导、维持细胞功能以及调节细胞间相互作用中扮演重要角色。在前期的几篇公众号推文中，小远已经给大家详细地介绍了一些常见的蛋白质翻译后修饰类型，包括磷酸化、泛素化和乙酰化。感兴趣的话大家可以点击以下链接进行查看哦！“蛋白翻译后修饰——磷酸化（一）”、“蛋白翻译后修饰——磷酸化（二）”、“蛋白翻译后修饰——泛素化”、“蛋白翻译后修饰——泛素化（二）”、“蛋白翻译后修饰——乙酰化”。今天，让我们一起来聊一聊另一个重要的蛋白质翻译后修饰——糖基化修饰。

蛋白质糖基化修饰背景介绍

真核生物中多肽和蛋白质分子经过核糖体合成后大多需要经过翻译后修饰才能正常的行使相应的生物学功能，蛋白质糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰方式。蛋白质糖基化是在糖基转移酶的作用下，通过糖苷键将蛋白质分子与糖链分子进行连接，形成糖蛋白的过程。蛋白质糖基化修饰不仅参与细胞间相互作用、细胞外基质组织的形成以及细胞信号传导等重要的细胞过程，还可以改变蛋白质的结构、蛋白质的定位和蛋白质的运输方式，影响蛋白质的稳定性、生物学活性和功能，在生物体内发挥着重要的生理功能。

蛋白质糖基化修饰类型

根据糖肽链的不同，蛋白质糖基化修饰主要包括N-糖基化、O-糖基化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定以及其他修饰类型等。

N-糖基化

N-糖基化是指在糖基转移酶的作用下将聚糖分子链连接到蛋白质天冬氨酸的氨基（-NH2）基团上形成糖蛋白的过程。并非所有蛋白中的天冬酰胺残基都能够发生N-糖基化，能够发生N-糖基化的蛋白具有一定的特征，其特征可表示为“Asn-X-Ser/Thr”，首先需要有一个天冬氨酸残基（Asparagine, Asn），“X”可以是除脯氨酸（Proline, Pro）以外的任何氨基酸，与X连接的氨基酸残基可以是丝氨酸（Serine, Ser）或苏氨酸（Threonine, Thr）。

 

《蛋白质翻译后修饰——糖基化》

图1 植物细胞中N-糖基化结构示意图(De Coninck et al., 2021)。N-聚糖的合成起始于内质网，在糖基转移酶的作用下聚糖分子链与蛋白质中的氨基残基连接形成糖蛋白，糖蛋白最终在高尔基体的囊膜中进行转运，经过进一步的修饰加工，会带上不同的糖链结构。

N-糖基化过程中，除了氨基酸序列具有一定的特征之外，聚糖也具有一定的特征。植物中常见的能够发生N-糖基化的聚糖形式主要包括3个葡萄糖（Glucose, Glc/Glu，本文中统一使用Glc），9个甘露糖（Mannose, Man）和2个N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc），即Glc3Man9GlcNAc2。

聚糖形成的主要场所是内质网，主要包括两个阶段：第一阶段主要发生在内质网的基质中，将两个GlcNAc连接到多萜醇（Dolichol）上，然后将五个Man与GlcNAc相连，生成Man5-GlcNAc2-Dolichol。第二阶段主要发生在内质网的管腔内侧，将四个Man和三个Glc分别连接到聚糖分子链中，得到成熟的聚糖（Glc3-Man9-GlcNAc2-Dolicol）。紧接着，在内质网的管腔中，特定的寡糖转移酶（Oligosaccharyl transferases, OTase）将成熟的聚糖转运到蛋白的天冬氨酸的氨基上，形成糖蛋白。

《蛋白质翻译后修饰——糖基化》

图2 植物细胞中蛋白质的N-糖基化过程(Okagu I et al., 2021)。

O-糖基化

O-糖基化是指在糖基转移酶的作用下将糖链分子连接到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸的羟基（-OH）基团上形成糖蛋白的过程。根据与丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸连接的单糖残基类型的不同，O-糖基化修饰分为黏蛋白型和非黏蛋白型。在黏蛋白型O-糖基化修饰中，与蛋白质连接的单糖残基是N-乙酰半乳糖胺（N acetylgalactosamine, GalNAc）；而在非黏蛋白型O-糖基化修饰中，与蛋白质连接的单糖残基可以是N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc）、岩藻糖（Fucose, Fuc）、甘露糖（Mannose, Man）、葡萄糖（Glucose, Glu）、木糖（Xylose, Xyl）、半乳糖（Galactose, Gal）等（Mulagapati S et al., 2017）。

与蛋白质翻译后修饰N-糖基化不同，O-糖基化没有固定特征的氨基酸序列，糖链分子也没有固定的核心寡糖结构，糖链分子中聚糖类型、聚糖数量呈现多样性，在分离糖蛋白的过程中缺乏从蛋白质中水解O-聚糖的通用酶，因此O-糖基化是随机的、多变的且没有规律可循的，这些原因导致发生O-糖基化的糖蛋白结构更为复杂。

糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定

糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol, GPI）锚定是真核生物中一种常见的蛋白翻译后修饰，通过多糖链将乙醇胺磷酸与蛋白质氨基酸的羧基端连接，肌醇上的甘油磷脂能够嵌入脂质双分子层中，将蛋白质锚定在细胞质膜上。GPI的结构较为保守，主要由乙醇胺磷酸（Ethanolamine phosphate, EtNP）、核心聚糖（Glycan）和磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol, PI）组成。核心聚糖由三个甘露糖（Man）和一个葡萄糖胺（Glucosamine, GlcN）残基组成，磷脂酰肌醇可以是1-烷基-2酰基磷脂酰肌醇、二酰基磷脂酰肌醇或肌醇磷酸神经酰胺等结构。核心聚糖分别与乙醇胺磷酸和磷脂酰肌醇相连，形成以“EtNP-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNα1-6myo-磷脂酰肌醇”为核心的GPI骨架结构。GPI锚定作为一种重要的糖基化修饰，影响信号转导、膜蛋白定位和胞间连丝运输等重要生物过程。
《蛋白质翻译后修饰——糖基化》

图3 GPI锚定(Beihammer et al., 2020)。（A）保守的GPI锚定骨架结构示意图。（B）内质网中GPI骨架结构的生物合成。

其他蛋白质糖基化修饰类型

植物中，除了以上提到的三种形式的蛋白质糖基化修饰之外，还有C-糖基化。C-糖基化是一种相对少见的蛋白质糖基化修饰类型，主要发生在黄酮碳苷的生物合成过程中。黄酮碳苷的糖基化修饰主要发生在黄酮碳苷的代谢途径中，在C-糖基转移酶的催化作用下把糖基转移到黄酮苷的碳原子上面的过程，或者先把糖基与黄酮中的碳原子连接再通过黄酮苷合成酶生成黄酮苷的过程。

关于糖基化的修饰类型就介绍到这里，大家如果感兴趣的话可以自己去查相关的文献资料进行学习哦。接下来让我们一起来聊一聊蛋白质糖基化修饰位点的预测工具和检测技术。

蛋白质糖基化修饰位点的预测

如果我们有感兴趣的蛋白质，想知道此蛋白质是否会发生糖基化的修饰，首先比较便捷的方法就是通过一些在线的蛋白质糖基化位点预测工具或数据库进行分析。以下是一些常用的蛋白质糖基化位点预测的网站：

（1）NetNGlyc，用于预测蛋白质序列中潜在的N-糖基化位点，网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/；

（2）NetOGlyc，用于预测蛋白质序列中潜在的O-糖基化位点，网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/；

（3）PredGPI，用于预测蛋白质序列中潜在的GPI锚定位点，网址：http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/；

（4）GPI-SOM，用于预测蛋白质中GPI锚定位点的神经网络工具，网址：http://gpi.unibe.ch/；

（5）UniProt，主要提供蛋白质序列的注释信息，同时也包括已知的糖基化修饰位点信息，网址：https://www.uniprot.org/。

蛋白质糖基化修饰的检测技术

通过一些在线的蛋白质糖基化修饰预测网站，我们可以找到可能会发生蛋白质糖基化修饰的一些蛋白，接下来可通过一些检测技术对其进行实验验证。糖基化修饰检测是鉴定蛋白质糖基化、糖基化修饰位点以及糖基化修饰水平的重要技术手段，常用的蛋白质糖基化修饰的检测技术主要包括蛋白质印迹、分子荧光标记法、凝胶电泳法、凝集素亲和技术和质谱技术等，并针对其中的凝集素亲和技术和质谱技术进行了举例。接下来让小远带大家一起了解一下吧。

蛋白质印迹

蛋白质印迹是一种常用的蛋白质糖基化检测方法，主要是根据抗原抗体特异性结合检测样品中的蛋白质。蛋白质印迹先将蛋白溶液样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离得到的蛋白产物转移到固相载体（如硝酸纤维素膜、醋酸纤维素、聚乙烯砜和活性尼龙等）上，将与固相载体结合的蛋白质作为抗原，与对应的一抗进行孵育，再与特定标记的二抗再次进行孵育，经过底物显色或放射自显影等方法检测蛋白质的表达水平。此方法具有较高的特异性和灵敏度，但需要制备特异性的抗体。

分子荧光标记法

分子荧光标记法是利用荧光探针与糖基化修饰蛋白相互作用，由于某些糖基化修饰蛋白具有自发荧光的特性，会产生荧光信号，因此可以通过荧光分光光度计测定荧光值（例如，激发波长370nm/发射波长440nm）从而实现对糖基化修饰蛋白的检测。此方法适用于具有自发荧光特性的糖基化修饰蛋白的研究。

凝胶电泳法

凝胶电泳法是一种用于生物大分子（蛋白质、核酸等）分离和检测的方法，同样可以用于蛋白质糖基化修饰的检测。凝胶电泳法基于生物大分子在电场中的迁移速率与其尺寸和电荷成正比的原理。在凝胶电泳中，样品通常首先在一个凝胶基质中分离，然后在电场中迁移，最后根据迁移的速率和分离效果来分析样品中的糖蛋白。此方法具有良好的分离能力，可以将不同大小和电荷的生物大分子分离开来。

凝集素亲和技术

凝集素可特异性吸附并结合一个或多个糖蛋白，利用凝集素这种特性可以特异性地对糖链或糖蛋白进行富集。不同的凝集素有着针对不同糖基的特异亲和性，比如伴刀豆凝集素对甘露糖具有特异亲和作用，麦胚凝集素对乙酰葡糖胺具有特异亲和作用，雪花莲凝集素对含有甘露糖型的糖链具有特异亲和作用等。

2022年，东北林业大学程玉祥课题组在Forestry Research杂志上发表了一篇题为“Lectin affinity-basedglycoproteome analysis of the developing xylemin poplar”的研究论文。本研究以杨树（Populus simonii×P. nigra）为研究材料，探究杨树木质部蛋白质糖基化修饰水平对杨树发育的影响。研究人员通过凝集素亲和技术对杨树木质部中的糖蛋白进行了富集分离，并结合质谱进行鉴定。结果共鉴定出鉴定出154个糖蛋白质，功能分析显示这些糖蛋白主要包含氧化还原酶、蛋白酶和蛋白激酶。

《蛋白质翻译后修饰——糖基化》
图4 杨树木质部中糖蛋白富集与鉴定流程(Cheng et al., 2022)。（a）糖蛋白的富集。从杨树木质部中提取粗蛋白，将糖蛋白与ConA、PNA、WGA和Jacalin凝集素亲和柱结合，洗脱的糖蛋白被胰蛋白酶消化，并进行质谱分析。（b）糖蛋白的验证。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的糖蛋白，分别用考马斯亮蓝染色和Pierce糖蛋白染色试剂盒染色，用来检测糖蛋白。

质谱技术

目前质谱技术在蛋白质糖基化修饰的分析方面占据重要地位。质谱技术首先会对蛋白质糖基化位点进行特异性富集，然后通过胰蛋白酶等将糖蛋白上面的糖链酶解下来，通过离子源将蛋白分子转化为带电离子，随后在质量分析器中利用磁场或电场将不同质荷比（m/z）的离子在时间或空间上进行分离，在检测器中依次对其进行测定。最终经过计算机数据处理后，得到包含m/z和含量信息的多肽质谱图，通过数据库的搜索和比对鉴定出相应的肽段，从而对蛋白质糖基化修饰进行鉴定和定量分析。此方法可以直接分析糖蛋白的分子量、糖基化位点以及糖链类型和结构等。

常用的质谱技术包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）两种。MALDI-TOF-MS灵敏度高、可操作性强且对样品中的无机盐和缓冲溶液具有较好包容性，对大多数蛋白质具有较好的适用性。ESI-MS具有选择性好、质量分析范围宽和样品消耗量较少的特点，在分析时样品溶液是连续不断导入ESI源内的，可以直接与高效液相色谱联用，同时实现样品的分离与鉴定。

2022年，浙江大学周艳虹课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“SPINDLY interacts with EIN2 to facilitate ethylene signalling-mediated fruit ripening in tomato”的研究论文，作者以番茄（S.lycopersicum L.cv.Micro-Tom）为材料，研究了蛋白质翻译后糖基化修饰对番茄果实成熟程度的影响。前期的研究发现SlSPY可以通过调节番茄果实中乙烯的含量调节果实的成熟度，SlSPY与SlEIN2之间可以通过相互作用促进果实的成熟。研究人员通过进一步的研究发现SlSPY可以增加SlEIN2结构的稳定性，使得SlEIN2在细胞核中的聚集增加。研究人员通过质谱技术分析发现SlEIN2在SlSPY的作用下可以发生O-糖基化修饰，进一步的分析确定了SlEIN2的两个O-糖基化修饰位点Ser771和Thr821，为研究SlEIN2糖基化修饰对果实成熟度的影响提供了新的见解。
《蛋白质翻译后修饰——糖基化》
图5 质谱技术分析SlEIN2的O-糖基化(Xu et al., 2023)。

小远叨叨
 

这篇文章中小远着重给大家介绍了蛋白质翻译后修饰之糖基化，首先给大家介绍了蛋白质糖基化的一些背景知识和蛋白质糖基化类型，其中蛋白质糖基化类型主要包括N-糖基化、O-糖基化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定和其他修饰等。然后给大家介绍了蛋白质糖基化位点的预测方法和检测技术，在检测技术中重点介绍了蛋白质印迹、分子荧光标记法、凝胶电泳法、凝集素亲和技术和质谱技术等。但由于篇幅有限，关于蛋白质糖基化在植物生长和应对生物或非生物胁迫过程中的具体应用未做介绍，下次如果有机会小远会给大家做详细的介绍哦。当然感兴趣的小伙伴也可以自行查阅相关文献资料进行学习哦。如果大家有感兴趣的其他话题也可以在微信公众号后台给我们留言哦。下期我们不见不散！
References：

De Coninck T, Gistelinck K, Janse van Rensburg H C, et al. Sweet modifications modulate plant development[J]. Biomolecules, 2021, 11(5): 756.

Okagu I U, Ohanenye I C, Ezeorba T P C, et al. Phytoglycoproteins and human health: current knowledge and future applications[J]. Applied Sciences, 2021, 11(12): 5532.

Mulagapati S H R, Koppolu V, Raju T S. Decoding of O-linked glycosylation by mass spectrometry[J]. Biochemistry, 2017, 56(9): 1218-1226.

Beihammer G, Maresch D, Altmann F, et al. Glycosylphosphatidylinositol-anchor synthesis in plants: a glycobiology perspective[J]. Frontiers in Plant Science, 2020, 11: 611188.

Cheng H, Liu J, Zhou M, et al. Lectin affinity-based glycoproteome analysis of the developing xylem in poplar[J]. Forestry Research, 2022, 2(1).

Xu J, Liu S, Cai L, et al. SPINDLY interacts with EIN2 to facilitate ethylene signalling‐mediated fruit ripening in tomato[J]. Plant Biotechnology Journal, 2023, 21(1): 219-231.

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