水稻是发展中国家的主要粮食作物之一，但各种胁迫因素会严重影响水稻的产量，其中水稻黄斑病毒（rice yellow mottle virus，RYMV）就是非洲最具破坏性的水稻病害之一，严重情况下产量的损失会超过50%。RYMV于1966年首次在东非被发现，此后在非洲很多国家都观察到这种病害，这种病毒主要通过昆虫进行传播，典型的症状包括严重的叶片斑驳、黄绿色条纹，营养期发育迟缓，生殖期不育等。通过一些预防措施，可以减少苗期植株的病害感染来改善植株的后期生长，但效果有限，并不能从根本上解决病害的问题，因此应对RYMV病害的最有效方法就是创制优良抗性品种。现阶段已鉴定出的3个主要抗病基因有：: RYMV1 (eIF(iso)4G1), RYMV2 (OsCPR5.1), RYMV3 (NB-LRR)，其中RYMV2介导的抗病基因是隐形遗传的，在水稻中也发现了两个同源物，且抗病性的功能机制尚不清楚。

近日，来自德国杜塞尔多夫大学Wolf B. Frommer1和法国蒙彼利埃大学Laurence Albar2团队，在《Plant Biotechnology Journal》杂志发表了题为“Rice Yellow Mottle Virus resistance by genome editing of the Oryza sativa L. ssp. japonica nucleoporin gene OsCPR5.1 but not OsCPR5.2”的文章。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑方法对水稻中的两个核孔蛋白基因CPR5.1和CPR5.2在水稻黄斑病中的抗病性进行了研究，发现两者在表达和结构上相似度很高，但只有oscpr5.1的功能缺失突变体会表现出明显的抗病性。

图1 CRISPR/Cas9诱导的转基因株系OsCPR5.1和OsCPR5.2的编辑类型

作者首先对OsCPR5.1和OsCPR5.2的表达和结构进行了分析，发现两者在不同的组织和发育阶段均有表达，在蛋白水平上有76%的相似性，有相似的结构，具有一个长螺旋延伸的螺旋束结构。利用CRISPR/CAS9进行基因组编辑，靶向诱导突变，创建了oscpr5.1和oscpr5.2的突变体材料（图1）。通过PCR检测获得了15个oscpr5.1的纯合突变的株系，以进行后续的表型分析研究，其中10个株系（oscpr5.1-A1、A2、A4、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7）存在移码或终止密码子的突变，3个株系（oscpr5.1-B8、B10、B12）发生了氨基酸改变的类型，2个株系（oscpr5.1-B9、B11）在结构域N端对应的区域中产生了42bp的碱基缺失（图1a）。同样也通过PCR检测获得了3个oscpr5.2的纯合突变的株系，3个株系（oscpr5.2-C1、C2、C3）存在移码突变或提前终止密码子的变异类型，导致该基因的功能丧失（图1b）。

图2 oscpr5.1和oscpr5.2突变体的RYMV的抗性评估

其次，作者对突变体材料进行了RYMV的抗性评价（图2）。以野生型Kitaake ,IR64作为感病对照组，oscpr5.1-T-DNA1和oscpr5.1-T-DNA2作为抗病对照，每个株系3-17株植株，进行3次重复实验，接种病菌2周后，利用双抗体夹心ELISA方法进行病毒载量的测定，结果发现ELISA方法检测的病毒载量与植株的表型观察结果一致，oscpr5.1突变体中具有移码突变或终止密码子提前终止的株系表现出明显的抗性，而具有移码突变的oscpr5.2的三个株系对RYMV表现出感病表型，。为了检测oscpr5.1突变体的抗性是否是由于防御反应的组成型激活，作者也进行了水稻纹枯病的抗性研究，发现所有的突变体材料均感病，且与野生型相似。因此，oscpr5.1的功能缺失可以赋予粳稻对RYMV的抗性能力，同时也推测oscpr5.1突变体的抗性可能是RYMV所特有的。

图3 oscpr5.1突变体的农艺性状

 为了检测oscpr5.1介导的RYMV抗性是否与植株生长受到限制有关系，作者进一步评估了突变体株系在没有病毒的条件下的关键农艺性状（图3），对12个不同的突变体株系的株高、穗长、分蘖数和粒重进行了测定，结果发现与野生型没有显著差异。其中，只有oscpr5.1-B4株系表现出生长缺陷，推测可能由于第2个位点的突变影响了植株的穗长性状，3个发生移码突变的突变体株系oscpr5.1-B5、B6、B7表现为分蘖数、粒重的增加。此外，作者也对oscpr5.2突变体进行了农艺性状分析，结果发现，与野生型相比，oscpr5.2-C3株系的株高和粒重均降低，但oscpr5.2-C1、C2的3个农艺性状与野生型没有显著差异。综上所述，oscpr5.1和oscpr5.2的突变体株系在农艺性状方面总体上与野生型没有显著差异。

图4 oscpr5.1 突变体的表皮毛表型

之前的研究表明atcpr5突变体在表皮毛发育中会表现出缺陷。作者也利用扫描电子显微镜（SEM）分析了oscpr5.1敲除突变体的表皮毛的表型，结果并没有观察到明显的表皮毛密度的结构差异（图4）。

图5 oscpr5.1，oscpr5.2双突变体的表型特征

研究表明，单一的功能缺失突变体没有表现出明显的植株损伤表型，并且在植株生长上没有明显的缺陷。作者推测是否双突变体株系会使植株受到明显的损伤，通过杂交方法创制了oscpr5.1,oscpr5.2双突变体，并进行了表型分析（图5），结果发现，双突变体也没有表现出明显的感病表型，且没有出现严重的生长发育迟缓。

该研究作者利用基因编辑的方法创制了水稻核孔蛋白基因oscpr5.1和oscpr5.2的突变体株系，进行了表型鉴定和农艺性状评估，发现单突株系和双突株系均没有表现出植株生长缺陷，但oscpr5.1突变体株系表现出明显的抗病性特征。研究为在水稻优良品系中创造RYMV抗性或其他抗性基因的有效累积提供了一定的实验指导，也为水稻抗黄斑病的研究提供了重要的理论基础。文章来源：植物生物技术Pbj