近日，中国农业大学食品科学与营养工程学院曲桂芹/朱鸿亮课题组合作在植物生物类TOP10期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了题为“Increasing flavonoid contents of tomato fruits through disruption of the SlSPL-CNR, a suppressor of SlMYB12 transcription activity”的研究论文，揭示了果实成熟调控因子SlSPL-CNR通过与类黄酮合成调控转录因子SlMYB12互作负向调控番茄果实类黄酮合成的功能机制。

类黄酮属多酚类次生代谢产物，具有典型的C6-C3-C6结构。天然类黄酮物质可防治心脑血管等疾病，对人类健康至关重要。番茄果实中，类黄酮随成熟逐渐合成，并主要积累在外果皮中。挖掘类黄酮合成的关键调控基因，创制富含类黄酮的果实，是提升果实品质的重要目标之一。

SlSPL-CNR属于SQUAMOSA promoter binding protein (SBP)-like家族转录因子，其对果实成熟调控机制主要来自于天然表观突变体Cnr(Colorless non-ripening)。Cnr遗传上被证明除自身启动子区域高度甲基化外，其他成熟相关基因启动子区域亦高度甲基化，表现为成熟后无乙烯无番茄红素积累呈现淡黄色表型。我们前期在《Horticulture Research》发现CRISPR/Cas9基因编辑的slcnr果实表现为野生型类似的表型，与天然Cnr表观突变体表型完全不同，预示调控果实发育成熟的SlSPL-CNR功能需重新评估。

MYB家族类转录因子SlMYB12作为番茄果实类黄酮积累的关键调控因子，被证实可靶向类黄酮合成路径众多基因，促进其转录表达并正向调控类黄酮合成。然而，果实组织中上游调控MYB12转录活性的分子调控网络仍然缺乏。

本研究首先利用蛋白免疫印迹杂交(Western blot)证明SlSPL-CNR蛋白在在果实组织中特异性表达，并且在外果皮中的表达量显著高于果肉组织（图1a,b）。随后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的三个独立株系slcnr-16, slcnr-22 和slcnr-23，表型观察发现SlSPL-CNR功能缺失使得番茄果实的外果皮呈现较黄的颜色（图1c）。RNA-Seq结果表明与野生型相比，slcnr-23伴随着大量SlMYB12靶向的类黄酮合成基因的表达水平显著升高（图1d-g）。液相质谱分析结果显示，slcnr突变体外果皮的总黄酮，以及类黄酮类化合物柚皮素查尔酮、柚皮素、山奈酚-3-芦丁苷和芦丁的含量均显著高于野生型（图1h）。另外，SlSPL-CNR稳定超量表达能够明显抑制类黄酮合成相关基因的表达，降低番茄果实的类黄酮含量。这些研究结果表明SlSPL-CNR能够通过负向调控类黄酮合成基因的表达抑制类黄酮合成。

随后，双荧光素酶报告实验显示SlSPL-CNR对SlMYB12的转录水平没有直接的调控作用，但免疫共沉淀结合双分子荧光互补实验证实SlSPL-CNR和SlMYB12能够在细胞核内发生互作（图1i,j）。进一步，转录激活分析显示，SlSPL-CNR能够直接抑制SlMYB12对类黄酮合成基因SlCHS2、SlF3H和Sl3GT的转录激活作用，而单独的SlSPL-CNR蛋白对它们的转录水平无明显影响（图1k）。因此，SlSPL-CNR能够作为SlMYB12的转录激活抑制因子来发挥功能，并通过抑制类黄酮合成基因的表达负向调控类黄酮的合成。

图1. SlCNR通过抑制SlMYB12的转录激活活性负向调控类黄酮的合成

综上，本研究揭示了SlSPL-CNR通过抑制SlMYB12转录活性负向调控类黄酮生物合成的分子机制，阐述了SlSPL-CNR-SlMYB12-SlCHS2/SlF3H/Sl3GT分子模块在类黄酮合成中的重要调控作用，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制了类黄酮含量显著提升的番茄果实（图2），为番茄品质改良提供了重要的基因资源和分子基础。

图2. SlCNR介导类黄酮含量显著提升的番茄果实创制的模式图

中国农业大学已毕业研究生周磊磊和孙宗艳为本文的共同第一作者，曲桂芹副教授和朱鸿亮教授为共同通讯作者。中国农业大学的朱本忠教授、傅达奇教授、曹建康教授等也参与了该项研究。本研究得到国家重点研发计划（2022YFD2100101）和国家自然科学基金（31972128）资助。

文章来源：植物生物技术Pbj