单碱基突变可以引起许多农艺性状的改变，最常见的原因是基因编码区内单碱基突变导致氨基酸发生突变，进而导致蛋白的功能发生改变，从而产生新的性状。现在常通过基于CRISPR-Cas9/Cas12a的单碱基编辑器ABE、CBE或PE系统实现对目标基因的单碱基突变，用以人工创制新种质资源。今天伯小远打算写一写在自然变异或通过EMS创制的突变体中，单碱基突变有哪些类型，是不是不止刚才说的编码区内的单碱基突变这一种情况呢，下面我们来一起看看吧。
本次推文的主要内容是：
图1 HS2和4332的穗形态（a）、小穗数（b）、抽穗期（c）的统计 (Chen et al., 2022)。
图2 FT-D1基因的多态性及STARP标记开发 (Chen et al., 2022)。作者通过小穗数和抽穗期差异显著的材料HS2和4332定位出与这两个性状有关的QTL在染色体7DS一段60M的区间内，再通过精细定位缩小至2.7Mb的区间内，在该区间内包含了一个著名的开花基因FT，通过对HS2和4332材料中该基因的测序发现FT在两个材料中存在一个碱基G的差异，位于第三个外显子中（a），将其命名为FT-D1，通过分子标记证明FT-D1是目标基因。根据FT-D1基因的多态性设计了STARP标记SFT-D1（b），根据该标记扩增不同小麦品种可以快速、经济地预测小穗数和抽穗期（c）。
图4 过表达SlWRKY33或ShWRKY33 (Guo et al., 2022)。该团队通过转录组数据发现对冷敏感的栽培番茄S. lycopersicum L ‘Ailsa Craig’中SlWRKY33基因不会被低温诱导表达，而耐寒的野生番茄S. habrochaites LA1777、S. pennellii LA0716中的ShWRKY33、SpWRKY33基因会被低温强烈诱导表达。分析SlWRKY33和ShWRKY33蛋白发现有6个氨基酸的差异，因而将‘Ailsa Craig’作为受体材料，转入35S:SlWRKY33（图中SlW33-OE#1/2材料）或35S:ShWRKY33（图中ShW33-OE#1/2材料），结果显示，这些过表达材料都增强了番茄的耐寒性，从这个结果可推测造成栽培番茄和野生番茄耐寒性的不同是由于WRKY33的表达模式的差异而不是其蛋白功能的差异。
图5 对SlWRKY33和ShWRKY33的启动子区域进行转录活性分析 (Guo et al., 2022)。作者通过双荧光素酶报告基因实验（LUC实验）发现SlWRKY33和ShWRKY33的启动子中有一个关键顺式作用元件W-box序列发生了一个单碱基变异（a、b），前者记为pSlW33，序列为TTGATT，后者记为pShW33，序列为TTGACT。冷胁迫下，通过LUC实验发现将pSlW33序列突变为mpSlW33后LUC/REN的值显著升高，而将pShW33序列突变为mpShW33后LUC/REN的值与对照无差异（c、d），更加确认了该W-box序列中发生的单碱基变异造成了SlWRKY33和ShWRKY33转录的差异。EMSA、ChIP-qPCR实验证明W-box序列pShW33可以与SlWRKY33或ShWRKY33蛋白结合，但W-box序列pSlW33却不能。根据以上实验结果推测，在冷胁迫下，野生番茄中的ShWRKY33蛋白可自激活ShWRKY33基因启动子中的W-box，但栽培番茄中由于SlWRKY33基因启动子中的W-box发生了单碱基变异，SlWRKY33无法结合自身基因SlWRKY33启动子。
图7 Url1突变体表型分析 (Fang et al., 2021)。作者发现与WT的扁平叶片相比，Url1突变体的叶片卷成圆筒状，F1的叶片呈半卷状（A-C），用甲苯胺蓝O染色发现在WT中，沿大叶脉和小叶脉被染成紫色的泡状细胞排列成三列，在Url1突变体中只观察到两列（D-G），WT和Url1成熟叶片的横切面（H-M），WT和Url1的LRI（N）、泡状细胞数量（O）和面积（P）。备注：泡状细胞数量和大小的减少会使叶片卷曲。
图8 URL1基因的图位克隆 (Fang et al., 2021)。作者利用图位克隆技术鉴定出在突变体Url1中LOC_Os06g10600的终止密码子后第679nt处发生了一个单碱基替换（A），该突变位点位于LOC_Os06g10600的3’-UTR区，将LOC_Os06g10600命名为URL1，该基因编码HD-ZIP IV家族转录因子ROC8。在Url1突变体中，URL1的3’-UTR中保守基序的单碱基突变，增强了URL1 mRNA的稳定性，使得URL1基因在突变体中的表达量显著高于野生型（B）。
2013年，哥伦比亚大学Li Xin团队在Nature communications杂志上发表了题为“Mitochondrial AtPAM16 is required for plant survival and the negative regulation of plant immunity”的研究论文，该团队通过EMS化学诱变筛选出拟南芥snc1增强子突变体muse5，并且发现MUSE5和酵母PAM16同源，定位于线粒体内膜，首次揭示了拟南芥MUSE5/TXR1/AtPAM16负向调控R蛋白SNC1介导的免疫反应，再次证明了线粒体参与植物免疫反应，拓展了对植物R蛋白介导的免疫信号的认识 (Huang et al., 2013)。
图10 muse5-1的图位克隆 (Huang et al., 2013)。拟南芥SNC1是一种R蛋白，snc1突变体使SNC1异常活跃，可抗病原菌，植株矮小。mos突变体为snc1抑制子突变体，这些突变体在表型上与野生型基本一致，但也抑制了snc1的抗病性。作者想筛选出snc1增强子突变体，因此通过EMS诱变mos snc1双突突变体，得到了类似于snc1突变体的muse突变体，植株矮小且抗病。作者通过群体进行图位克隆，最终克隆到At3g59280发生了突变，突变的位置为内含子与外显子的剪切处，碱基G突变为A（a、b），对突变体的cDNA与野生型比较，发现碱基G在muse5-1中缺失（c），最终导致MUSE5蛋白改变。通过比对蛋白序列，发现MUSE5与酿酒酵母中的PAM16有35%的相似度，均存在J-Like保守结构域（e虚线处）。
图11 AtPam16突变体的抗病性分析 (Huang et al., 2013)。基因AtPAM16（即MUSE5）突变，造成mos4 snc1抗病性恢复，所以推测AtPAM16可能是一个免疫负调控因子，从表型上看，AtPam16-1 （muse5-1）与AtPam16-2（txr1-1，txr1-1是前人报道的At3g59280基因的突变体）均小于野生型，AtPam16l（At5g61880 T-DNA突变体，At5g61880编码产物与MUSE5类似）与野生型类似（a）；从抗病性检测来看，结果可见图b、c。综合来看，基因AtPAM16突变引起了拟南芥的抗病性，因此AtPAM16是一个免疫负调控因子。
图13 mdm-siR277-1/2通过调控MdRNL1/2/3/4/5基因的表达影响苹果的ALT1易感性 (Zhang et al., 2018)。作者在感病品种GD叶片中接种ALT1，发现mdm-siR277-1/2被诱导（A），接种2h后其靶基因MdRNL1/2/3/4/5的mRNA水平相应降低（B），接着利用STTM沉默mdm-siR277-1/2（C、D），发现其靶基因MdRNL1/2/3/4/5表达量增加（E），并且发现叶片感染症状减轻（F）、感病率降低（G）。随后作者在抗病品种HF叶片中接种ALT1，发现mdm-siR277-1/2未被诱导（H），并且其靶基因MdRNL1/2/3/4/5的表达升高（I），接着在抗病品种HF中超表达MdhpRNA277后发现mdm-siR277-1/2表达升高（J），而其靶基因MdRNL1/2/3/4/5的表达降低（K），叶片感病症状加重（L）、感病率升高（M）。
图14 GD和HF中MdhpRNA277启动子的三个SNP (Zhang et al., 2018)。作者克隆了MdhpRNA277的启动子序列（1711bp），并确定了GD和HF中 MdhpRNA277启动子的三个SNP（分别位于-1506、-1186和-175bp处）。
图15 pMdhpRNA277启动子区motif b对其活性至关重要 (Zhang et al., 2018)。作者为了确定哪个SNP对pMdhpRNA277的活性至关重要，将pMdhpRNA277-HF中的三个SNP（motif a、b和c）突变为GD序列，并将突变的启动子与GUS融合，发现当pMdhpRNA277-GD中的motif b突变为与pMdhpRNA277-HF中相同的序列（G至T）时，在接种ALT1后的GD和HF幼苗中均未检测到GUS染色（A、B）。
图17 miR319a129突变体在花发育中表现出明显的缺陷 (Nag et al., 2009)。drnl-2突变体花瓣长度不规则（A），drnl-2 miR319a129双突变体花瓣减少（B、C），miR319a129花药发育畸形（E、F），转化含有miR319a基因的3.7kb基因组DNA的T-DNA可恢复miR319a129突变体表型（G），与野生型相比miR319a129突变体雄蕊较短（D、H、I），与野生型相比miR319a129突变体花器官较小（J）。
图18 miR319a的单碱基突变会使其靶标基因TCP在花序中的表达增加 (Nag et al., 2009)。作者通过图位克隆的方法克隆了miR319a129基因，发现miR319a129突变体在成熟miR319a（At4g23713）的第12位含有G到A的单碱基突变（A），并且发现miR319a129功能缺失会使其靶标基因TCP在花序中的表达增加（B）。
图20 58N和58S在自然长日照和短日照条件下的花粉育性 (Ding et al., 2012)。作者发现58N（左）在长日照条件下生长时花粉可育，58S（中）在长日照条件下生长时花粉完全不育，58S（右）在短日照条件下生长时花粉部分可育（A-D）。
图21 pms3的图位克隆 (Ding et al., 2012)。已有文献表明pms3是将58N转变为58S的原始突变，作者通过比较58S、DH80和58N中28.4kb区域的测序发现一个由58N中的G替换58S中的C而产生的SNP（A-E）。
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