由于全球对食用油的需求不断增加，异源多倍体芸苔属物种甘蓝型油菜和芥菜已成为重要的油籽作物。榨油后留下的籽粕富含蛋白质，是牲畜大豆蛋白饲料的有前景的替代品。然而，种子中存在大量芥子油苷，将种子芥子油苷含量 (SGC) 降低至每克干种子重量 (DW) 小于30 μmoles 的双低油菜籽质量水平一直是油菜籽和芥菜育种的主要目标。近日来自印度国家植物基因组研究所Naveen C. Bisht研究小组在Plant Biotechnology Journal发表了题为Targeted editing of multiple homologues of GTR1 and GTR2 genes provides the ideal low-seed, high-leaf glucosinolate oilseed mustard with uncompromised defence and yield的文章，通过使用 CRISPR/Cas9 系统对芥菜中的多个 BjuGTR1 和 BjuGTR2 同源物进行靶向编辑，提高了油和籽粕的质量，同时又不损害芥子油苷对植物提供的保护。
该研究选择含有高种子芥子油苷的芥菜品系 Varuna（属于印度芥菜基因库的巨型品种）进行基因编辑。Varuna 的 GTR1 和 GTR2 基因各含有 6 个功能同源物。为了实现 SGC 的大幅减少，我们的目标是同时靶向大多数 BjuGTR1 和 BjuGTR2 同源物。对 CRISPR-P V2.0 中 BjuGTR 同源物的扫描发现了一个高度保守的 20 个核苷酸 (nt) 区域，从该区域设计了 3 个向导 RNA（gRNA1、gRNA2 和 gRNA3），它们总共可以靶向 9 个 BjuGTR 同源物，并且具有 100% 的相似性。BjuGTR1-A3 和 BjuGTR1-B3 在其相应的原型间隔子相邻基序 (PAM) 位点（AGG 至 AGA）中显示出序列差异，因此未考虑在研究中进行编辑。gRNA1、gRNA2 和 gRNA3 的靶位点映射到各自 BjuGTR 的第二个外显子（图 1），对应于编码的 BjuGTR 蛋白中的第二个跨膜结构域。Varuna 按照农杆菌介导的遗传转化方案进行转化。总共产生了 37 个初级转化事件（ T0 代），并使用 HPLC 估算了从每个 T0 事件收集的 T1 种子中的种子芥子油苷含量 (SGC)。GTR1::GTR2(GEd) 品系 T1 种子中的 SGC 范围为 6.21 至 145.88 μmoles/g DW，而野生型 (WT) Varuna 中的 SGC 为 146.09 ± 4.59 μmoles/g DW 。37 个 T0 事件中有 30 个显示 SGC 显着降低，使其达到或低于双低油菜籽质量标准 <30 μmoles/g DW。与 WT Varuna 相比，GTR1::GTR2(GEd) 事件的 T1 种子中所有主要脂肪族芥子油苷组分（黑芥子苷、葡糖苷和芥子油苷）均显着减少。
图1. gRNA 靶位点的基因组定位和 GTR1::GTR2(GEd) 载体构建
GTR1::GTR2(GEd) 事件中 SGC 的大幅减少促使研究者筛选目标 BjuGTR 同源物中 CRISPR/Cas9 诱导的突变。总共选择了22个代表性T0事件用于筛选BjuGTR1和BjuGTR2同源物的突变。在所有 22 个 T0 事件中，九个 BjuGTR 同源物的编辑频率范围为 86% 至 100%，显示总体突变效率 > 84%。BjuGTR2-B3 显示出最低的突变频率 (31.81%)，这可能是由于其与所使用的三种 gRNA 不匹配所致。由于 CRISPR/Cas9 的特性，检测到的所有突变均位于 PAM 位点上游 3-4nt 处。发现大约 90% 的突变是单核苷酸插入，导致移码突变。双等位基因纯合子 (BHo) 和双等位基因杂合子 (BHt) 是 T0 事件中 BjuGTR 中观察到的最常见突变。在具有低 SGC（17 个事件 <30 μmoles/g DW）和高 SGC（5 个事件 >70 μmoles/g DW）的 T0 事件中比较所有 BjuGTR 同源物的突变谱。序列分析表明，SGC 较低的品系在大多数目标 BjuGTR1 和 BjuGTR2 同源物的等位基因中都表现出移码突变，导致基因功能完全消失。在含有高 SGC 的 T0 事件（L9、L24、L13、L32 和 L49）中，大多数 BjuGTR2 同源物要么未编辑，要么处于单等位基因 (Mo) 编辑状态（图 2）。
图2. 分析 22 个 GTR 编辑的T0事件中CRISPR/Cas9诱导突变的BjuGTR 编辑模式
总之，该工作清楚地表明，同时编辑多个 BjuGTR1 和 BjuGTR2 同源物（但不是全部）可以产生低 SGC、高 LGC 芥菜品系，且具有不受影响的防御和产量性能。通过测试 GTR 编辑品系对抗坏死性病原体 (S. sclerotiorum) 和普通害虫 (S. litura) 的性能，证明了高叶芥子油苷含量的益处。GTR 编辑品系中的高叶芥子油苷帮助它们在对抗测试的害虫和病原体方面表现得更好或与 WT Varuna 相当，同时比双低油菜籽质量品系显示出显着优势，后者在植物的所有部分都减少了芥子油苷 。
