CRISPR screen——极具潜力的高通量筛选技术

2023年7月12日 0条评论 427次阅读 1人点赞

本次推文内容速览：

《CRISPR screen——极具潜力的高通量筛选技术》

01
简介
正向遗传筛选方法在破译重要农业性状的分子机制方面发挥着重要作用，这通常依赖于自然突变、物理化学诱变、T-DNA插入等产生的遗传突变。然而，利用这些方法去鉴定所需表型的基因型费时费力。因此，研究人员开发出了基于RNAi的大规模筛选方法，但该技术仍然存在相当大的脱靶效应和不完全的敲除表型，同时受到了行业法规的限制。

作为一种强大的基因编辑工具，CRISPR/Cas正在彻底改变基础研究和作物育种，目前已发展成为高效、简单和可编程的大规模编辑（CRISPR screen）技术。CRISPR screen又可以称为全基因组基因编辑或者高通量基因编辑技术，目前在哺乳动物研究领域特别流行，且成效显著。随着该技术的不断发展，CRISPR screen也被报道用于作物，包括水稻、番茄、大豆和玉米等(Jacobs et al., 2017；Lu et al., 2017；Meng et al., 2017；Bai et al., 2020)。各种作物大规模编辑的广泛运用很可能会导致未来几年基因编辑种质的激增。此外，高质量、高覆盖率和均匀分布的编辑突变体文库的开发将为功能基因组学研究和作物改良提供宝贵的遗传资源。

CRISPR screen技术流程包括选择合适的基因编辑工具、设计gRNA数据集、文库构建、大规模遗传转化、基因分型、表型鉴定和种质资源管理这几个部分。今天伯小远主要为大家介绍CRISPR screen技术流程以及使用CRISPR screen技术所取得的成果。
02
CRISPR screen技术流程

2.1 CRISPR screen的基因编辑工具

选择合适的基因编辑工具往往是CRISPR screen流程的第一步，这次主要为大家介绍CRISPRko、Knockin、Base editor、Prime editor和CRISPRa/i的应用，大家如果想知道这些工具的原理可以看看往期的公众号文章哦！

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图1 选择合适的基因编辑工具是CRISPR screen流程的第一步(Liu  et al., 2023)。

2.1.1 CRISPRko

CRISPR/Cas是一种能够精确切割靶DNA的可改造核酸内切酶系统，通常由编码核酸酶的Cas蛋白和用于靶向的引导RNA（gRNA）两部分组成。对于大规模的基因编辑，编辑工具必须是高效和稳定的。目前已经发现几种基因编辑工具适合在植物中进行CRISPR screen。在植物中用于CRISPR筛选的最常用的核酸酶是SpCas9。SpCas9通常由位于5′-NGG-3’PAM（Protospacer-adjacent motif）序列前20nt的sgRNA引导，产生平末端的DNA双链断裂（Double strand breaks，DSBs），导致核苷酸的插入或缺失（indel）。Indels可以诱导编码序列中的移码突变，从而敲除相应的基因（CRISPRko）。可以查看“快速get全套基因编辑实验方法！”这篇文章了解原理哦。

尽管SpCas9介导的基因敲除是目前流行的CRISPR筛选工具，但也存在其它值得推荐的基因编辑工具。例如：1）具有更多可识别PAM的SpCas9变体Cas9 NG（将PAM识别序列由NGG简化为NG，还能识别NAC、NTG、NT和NCG等PAM序列）和SpRY（几乎不受PAM序列的限制，但它对NNR和NRN PAM具有较大的偏好性，N=任意碱基，R=A/G）(Tang  et al., 2017；Manghwar  et al., 2019)；2）识别富含AT PAM的Cpf1，因为Cpf1/Cas12a的切割位点位于其PAM的远端，所以它通常产生大的缺失（例如20bp）。SpCas9与某些酶（如APOBEC3A和UNG）的融合也可以诱导类似的缺失，这些工具特别适合于筛选启动子内的顺式调节元件(Wang et al., 2020；Tian  et al., 2022)。

2.1.2 Knockin

在哺乳动物细胞的研究中，使用5’端和3’端带有两个硫代磷酸酯键的平末端5’磷酸化双链寡核苷酸（dsODN），能够促进寡核苷酸靶向整合到基因组中。这是由于硫代磷酸酯键修饰能够稳定细胞中的寡聚体，并且5’磷酸化可以促进非同源末端连接（NHEJ）修复机制。2020年7月6日，中科院上海分子植物卓越中心逆境中心朱健康团队在Nature Biotechnology在线发表题为“Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice”的研究论文。他们在哺乳动物研究的基础上使用经修饰的供体DNA和CRISPR-Cas9将多达2049个碱基对（bp）的序列（包括增强子和启动子）插入水稻基因组，效率达到25%。这项重大突破性进展为敲入在植物中进行CRISPR screen的提供了另一个有价值的工具(Lu et al., 2020)。

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图2 水稻靶向插入供体DNA的优化。为了验证修饰供体，使用来自水稻乙醇脱氢酶1（ADH1）的5’非翻译区的60bp翻译增强子（ADHE）作为供体DNA，用于插入水稻的主要耐盐基因座SKC1(Lu et al., 2020)。（a）经化学修饰后的ADHE序列，5’端和3’端具有硫代磷酸酯键以及5-磷酸化修饰；（b）ssADHE、dsADHE（未修饰）和ADHE（修饰后）的核苷酸多态性（框中）。（c）SKC1及其sgRNA靶点（下划线）、PAM序列（加粗）和5’UTR（白色方框）中插入供体（灰色方框）的示意图；（d、e）比较水稻愈伤组织中使用ssADHE、dsADHE和ADHE靶向插入频率的比较；（e）“Forward（正向）”和“Reverse（反向）”代表ADHE在靶位点的方向，“Seamless（无缝）”代表在ADHE及其侧翼基因组序列之间的连接处没有indel。

2.1.3 碱基编辑器（Base editor）

碱基编辑器可以在不诱导DSBs的情况下进行单核苷酸的编辑，是一种单碱基替换类型的CRISPR screen。目前已有好几种碱基编辑器，例如，实现C转换为G的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和实现A转换为T的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。这些编辑器最初版本的编辑效率不足以用于CRISPR screen。“精准基因编辑技术的研究进展”这篇文章有描述ABE和CBE的技术原理，感兴趣的同学可以看看哦！但随着近几年的不断改进，一些碱基编辑器的编辑效率能够处理CRISPR screen，下面仅部分举例：

2.1.3.1 CBE BE3

David Liu实验室结合细胞内源修复机制开发第三代碱基编辑器BE3（rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI）对人类细胞进行处理，编辑效率平均约为37%，该碱基编辑器是目前较为广泛使用的CBE版本(Komor et al., 2016)。

2.1.3.2 A3A/Y130FCBE_V04

电子科技大学张勇课题组及其合作者在Plant Biotechnology Journal发表了题名“Improved plant cytosine base editors with high editing activity, purity, and specificity”的研究论文。该团队通过构建7种不同脱氨酶胞嘧啶碱基编辑系统CBE_V01，并基于水稻及拟南芥原生质体转化、高通量测序，对水稻内源多GC位点及拟南芥甲基化位点的有效定向碱基编辑事件进行检测，发现A3A/Y130F-CBE_V01 对C到T的编辑效率最高（图3c、f）(Ren et al., 2021)。

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图3 植物细胞中7种不同CBE碱基编辑器的比较(Ren et al., 2021)。（a）水稻中四个富含CG的位点（OsCGRS55至OsCGRS58）用于评估不同的CBE；（b）CBE_V01系统，注意PmCDA1 UGI融合在nCas9的C端；（c）在水稻原生质体的四个富含CG的位点上，7个CBE_V01编辑器的编辑效率；（d）7个CBE_V01编辑器在水稻原生质体四个靶位点的编辑窗口和编辑效率；（e）编辑拟南芥中AtFWA启动子中甲基化区域的示意图；（f，g）在拟南芥原生质体中用AtFWA-sgRNA01编辑四个CBE_V01编辑器的效率和窗口。

2.1.3.3 ABE TadA8e和ABE TadA9

中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队在Molecular Plant上在线发表了题为“High-Efficiency and Multiplex Adenine Base Editing in Plants Using New TadA Variants”的研究论文。该团队为了实现对现有植物腺嘌呤碱基编辑器的优化升级，通过对三种腺苷脱氨酶TadA变体TadA8e、TadA8.17、TadA8.20进行了评估，并在此基础之上开发出全新版本TadA9，结果显示其中TadA9和TadA8e在多个测试靶位点处的碱基编辑效率较高（图4A），这项结果在作物分子育种的发展方面具有巨大的潜力(Yan et al., 2021)。

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图4 TadA变体与SpCas9n变体结合，并能够在水稻不同PAM序列上进行有效的A转换为G的编辑(Yan et al., 2021)。（A）CRISPR/SpCas9n-NG ABE在T0转基因水稻愈伤组织中靶基因位点（NG-PAMs）上腺嘌呤编辑效率的比较；（B）使用CRISPR/SpCas9n-NG ABE在T0转基因水稻株系的靶基因组区域内A到G的转换编辑效率；（C）CRISPR/SpCas9n-NG ABE的平均腺嘌呤编辑效率；（D）rBE53和rBE65在转基因水稻愈伤组织株系中的碱基编辑效率汇总。具有杂合、纯合、双等位基因突变和嵌合突变的转基因水稻愈伤组织分别缩写为He、Ho、Bi和Ch。

除了ABE和CBE单碱基编辑外，中科院上海分子植物卓越中心逆境中心朱健康研究组与陆钰明研究组共同优化得到的CGBE碱基编辑器，它可以在水稻中实现高效的C到G的颠换编辑。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队和李家洋团队合作开发了一种内源基因突变碱基编辑器STEME，它将胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脱氨酶ecTadA-ecTadA7.10同时融合在nCas9的N端，一起实现C到T和A到G的转换，这项技术目前主要用于植物基因的定向进化。随着这些碱基编辑器的进一步的改造，或许将来可以将它们应用扩展到CRISPR screen技术中。

2.1.4 先导编辑器（Prime editor）

Prime editor是另一个具有用于大规模基因编辑潜力的工具，可以实现自定义的碱基编辑。想了解Prime editor技术原理的小伙伴，可以查看“PE是如何一步步上位的”。尽管编辑效率相对较低，但现在有一系列改进的工具使得Prime editor有望运用到CRISPR screen中。2022年3月24日，中科院遗传发育研究所高彩霞团队及曹晓风团队在Nature Biotechnology上发表了题为“An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants”的研究论文，该研究通过去除核糖核酸酶H结构域来改造逆转录酶，并掺入具有核酸伴侣活性的病毒核衣壳蛋白，改造后的Prime editor称为ePPE。ePPE与PPE相比，各个内源位点的碱基替换、缺失和插入的效率都有提高，平均提高了5.8倍，且没有观察到副产品或脱靶编辑的显著增加。该研究使用ePPE生成耐受磺酰脲类和咪唑啉酮除草剂的水稻植株，观察到编辑频率为11.3%，而使用PPE的编辑频率为2.1%（图5b）(Zong et al., 2022)。

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图5 PPE和ePPE在植物中产生突变(Zong et al., 2022)。（a）PPE和ePPE在四个目标位点诱导抗性水稻愈伤组织编辑效率的比较；（b）PPE和ePPE在OsALS-T6位点上诱导的T0突变体的不同突变类型的效率；（c）OsALS-T6位点发生Trp548Met突变会赋予水稻除草剂抗性。将WT OsALS-T6与T0-1、T0-3和T0-4突变体中的序列进行比较。PAM以红色突出显示，sgRNA以下划线突出显示。野生型（左）和杂合OsALS W548M突变体（右）的表型。

2023年6月29日，中国农业大学小麦研究中心宗媛团队在Genome Biology上发表了题为“Efficient and versatile multiplex prime editing in hexaploid wheat”的研究论文。研究者多角度对植物Prime editor系统进行了全方位的优化，在六倍体小麦中开发了一种升级版先导编辑器ePPEplus，在逆转录酶中引入新的氨基酸突变位点V223A。ePPEplus与PPE和ePPE相比，效率分别平均提高了33.0倍和6.4倍。重要的是，建立了一个强大的多重引物编辑平台，在小麦中实现了2~8个基因的同时精准编辑（最高可同时编辑21个基因组的位点（Genomic loci）），总编辑效率高达74.5%（图6a和b）。值得注意的是，51株T0再生植株中有6株（11.8%）发生了8个基因的同时编辑，实现了小麦植株中不同有利等位基因的聚合（图6c和d）(Ni et al., 2023)。这拓宽了引导编辑系统的应用范畴，为作物优势性状叠加提供新的技术支持。

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图6 ePPEplus介导的小麦植株多重精确基因编辑(Ni et al., 2023)。（a）ePPEplus在小麦中对多个内源基因进行引导编辑的流程；（b）小麦植株中单个靶向基因的突变效率；（c）小麦植株多重引物编辑的效率；（d）同时编辑不同数量的基因或基因组基因座的比例。n=38是指同时携带两到八个突变基因的植物数量。

2.1.5 CRISPRa和CRISPRi

除了常规的基因编辑外，研究人员还通过dCas9融合转录激活因子（如VP64和VPR等）或阻遏物（如KRAB和SRDX等），开发了CRISPR/dCas9基因激活系统（CRISPRa）和CRISPR/dCas9基因抑制系统（CRISPRi），能够分别实现靶基因的转录上调和下调(Tang et al., 2017；Pan et al., 2021；Zhang et al., 2022)。CRISPRa和CRISPRi有望用于植物的CRISPR screen。大家想具体了解这两个工具，可以查看“谈谈CRISPR/dCas9系统的“百变”应用（一）”

2.2 设计gRNA数据集

对基因编辑的候选位点进行生物信息学分析（如QTL和GWAS）对CRISPR screen非常有帮助。将候选的编辑位点缩小到一定范围在很大程度上可以减轻整体实验的负担。选择合适的编辑器（如上所述）后，下一步是设计gRNA文库。除了考虑编辑效率外，还必须仔细考虑脱靶的情况。目前，已有数十个gRNA设计网站可以使用（表1）。其中一些程序允许用户在整个基因组范围内进行多个靶标设计例如：CRISPy web和CRISPR Library Designer（CRISPR Library Designer软件下载地址：https://github.com/boutroslab/cld）(Blin et al., 2016；Heigwer et al., 2016)，这对于获得覆盖候选区域的整个gRNA数据集非常有用。

表1 gRNA设计网站(Liu et al., 2023)。

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图7 CRISPR screen的大小取决于靶基因的数量，通过适当的生物信息学分析可以有效地减少靶基因的数目。gRNA可以通过各种程序的批量设计获得，从而产生gRNA数据集(Liu et al., 2023)。

2.3 构建文库

gRNA数据集设计完成后就是将sgRNA大量克隆到CRISPR/Cas质粒中，特别重要的是确保克隆的准确性和质粒库的gRNA分布，可以使用负选择标记ccdB，以提高准确性；通过使用高覆盖率的文库（例如：＞30×）来保持gRNA的分布。通过高通量测序（NGS）进行仔细评估后，进行后续转化。

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图8 gRNA寡聚体可以在芯片上合成，然后克隆到合适的质粒载体上，获得大规模基因编辑文库(Liu et al., 2023)。

2.4 大规模遗传转化

哺乳动物CRISPR screen通常将混合的gRNA文库通过慢病毒大量转染到培养的细胞中，这种方法极大地促进了全基因组分析。在植物中，可以通过混合农杆菌进行类似于哺乳动物CRISPR screen的混合策略去侵染植物。

在哺乳动物中，混合转染策略的关键点是必须保证一个细胞接收一个gRNA，否则多个sgRNA的存在将导致多重编辑。农杆菌和慢病毒的作用相似，通常会将多个外源DNA整合到宿主基因组中。目前，这些问题已经在哺乳动物中通过控制转染的多重性（MOI，每个细胞递送的病毒粒子的数量）得到了解决。通常使用相对较低的MOI（0.3-0.5）来确保一个细胞主要只接收一个病毒粒子(Shalem et al., 2015)。在使用低“MOI”的农杆菌的水稻愈伤组织的混合转化中也实现了这种“一对一”的效果(Lu et al., 2017)。然而，最佳农杆菌浓度在不同植物物种（如番茄和拟南芥）之间可能有很大差异，因此需要在进行大规模混合遗传转化之前确定。

与哺乳动物中直接对细胞进行检测不同，植物中的CRISPR screen通常需要通过组织培养来获得编辑的植株集合，再进行检测。因此，在植物中进行CRISPR screen要困难得多。

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图9 大规模遗传转化(Liu et al., 2023)。

2.5 基因分型、表型鉴定和种质保存

通过大规模的转化，研究人员可以获得大量经过编辑的植物，随后就需要对这些植物进行大规模的基因分型。一般采用NGS方法，NGS分析中barcode可以很容易地从突变体中扩增gRNA，并批量鉴定每种植物中的gRNA。另一种基于NGS的方法，称为Hi-TOM，仅需两次普通PCR即可快速完成高通量测序文库的构建，并用配套的Hi-TOM（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）在线工具自动解析高通量测序数据，可以检测包括SNP分子标记及基因编辑突变在内的任何复杂序列信息，同时获得详细基因型信息。一旦进行基因分型，基因型和表型就很容易关联起来，但由于潜在的脱靶编辑，需要进一步验证。与哺乳动物中基于细胞的“瞬时”筛选不同，经过编辑的植物可以培育出种子进行长期保存，仔细管理CRISPR screen获得的突变体库，可以为未来积累珍贵的基因编辑种质资源。

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图10 进行高通量基因分型，通过表型鉴定选择性状优良的编辑种子进行管理(Liu et al., 2023)。

03
植物CRISPR screen应用

CRISPR screen目前主要用于大规模CRISPRko来构建全基因组突变体库或者分析物种某个基因家族，用于启动子分析对多效基因进行平铺删除以发掘新性状，该应用可以查看往期文章“转录因子IPA1，次次都能发顶刊是怎么做到的？”。

早在2017年，中科院遗传发育所李家洋及高彩霞研究团队和中科院上海分子植物卓越中心陆钰明以背靠背的形式分别在Molecular Plant发表了以利用CRISPR/Cas9方法创制水稻突变体库的研究论文(Lu et al., 2017；Meng et al., 2017)。

2021年10月，华中农业大学谢卡斌课题组在Molecular Plant期刊上发表了题为“A FLASH pipeline for arrayed CRISPR library construction and the gene function discovery of rice receptor-like kinases”的研究论文。该研究设计了一种以PCR片段长度作为Cas9/gRNA载体标签的策略（PCR fragment-length markers for gRNAs distinguishing，简称FLASH标签），它可以通过常规PCR和凝胶电泳读取每个载体和转化植株的gRNA信息(Chen et al., 2020)。利用此方法，该课题组创建了靶向敲除1072个水稻类受体激酶的基因编辑材料，为快速鉴定抗病、抗逆相关的基因提供了新资源。

表2 植物CRISPR screen汇总(Liu et al., 2023)。

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小远叨叨
由于篇幅的关系，本次的文章到这里就结束了。这次伯小远主要为大家讲解了CRISPR screen技术流程以及应用，大家对文中提到的研究论文感兴趣的话，一定要找原文献来读哦！另外，我司可提供CRISPR突变体库、基因编辑（包括单基因多靶点编辑、多基因编辑、基因家族编辑、启动子编辑、非特异性靶标编辑、microRNA编辑、IncRNA编辑等）、先导编辑以及平铺删除等服务，有需要的小伙伴可致电详询哦!

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