近日，河南农业大学唐贵良教授、彭廷教授和王潇然副教授三个课题组合作在国际植物领域主流期刊Plant Biotechnology Journal在线发表题为“A high-efficiency gene silencing in plants using two-hit asymmetrical artificial MicroRNAs”的研究论文。该论文报道了一种全新的two-hit非对称amiRNA（以下简称“two-hit amiRNA”）植物基因沉默技术。
Artificial miRNA（amiRNA）是一种人工设计21nt miRNA，可以通过转基因在受体内表达，并借助生物体内源miRNAs沉默机制对目标基因进行沉默。尽管已经证实，基于amiRNA创制的多种基因沉默技术均可以发挥作用，但其沉默效率通常受到靶点序列和位置影响。因此，一直以来amiRNA的设计和应用尚缺乏统一的规律可以借鉴。
研究人员通过对多种植物和动物内源miRNA进行统计分析发现，miRNA/miRNA*的双链结构通常在距离miRNA 5’端第1和第12位碱基处发生错配，并通过错配概率统计初步明确了amiRNA设计中的碱基错配类型。研究人员进一步以pOT2-Poly-Cis为基础载体，将拟南芥修饰后的miR168a前体骨架与之整合，在此基础上，以前体骨架作为引物结合位点将设计完成的amiRNA快速构建到载体上（one-hit）。为了提升上述结构沉默效率，研究人员对上述结构进行串联，形成two-hit结构，通过对比发现，two-hit amiRNA沉默效率显著高于one-hit amiRNA（图1）。
图1 one-hit和two-hit amiRNA结构及在拟南芥中对EGFP的沉默效果
为进一步研究two-hit amiRNA在植物体内的作用效果，研究人员利用该沉默系统分别对RISC（RNA-induced silencing complex）核心成员AGO1、AGO7以及SnRK家族，ARF家族等多个基因进行沉默，结果证实two-hit amiRNA具有非常高的基因沉默效率，甚至可以同时沉默基因家族内多个成员（图2）。同时，利用此系统分别在番茄、水稻及拟南芥中过表达其内源miRNA发现，目标miRNA表达显著上调，其对应靶基因显著被抑制。在对容易造成miRNAs脱靶的基因（LFY和TRY基因）进行沉默后证实，two-hit amiRNA仅对非靶基因表达造成微弱影响。综合多个结果可知，two-hit amiRNA基因沉默技术兼具有高效性和高特异性的双重优势。
为便于不同研究团队使用此沉默系统，研究人员开发了网页版amiRNA设计工具（http://www.mirnainfo.com/miRNADesignOne.aspx、http://www.smallrna.mtu.edu/Tang_Website/submit.htm），该工具可同时适用植物和动物的amiRNA设计。CRIPSR/Cas9系统是近年来使用率最高的基因沉默技术，但因其能够产生等位基因功能缺失，可能造成致死，因此作用于转录后调控，且具备高效沉默和靶向特异优势的two-hit amiRNA系统就成为反向遗传学研究技术领域的重要补充。
图2 利用two-hit miRNA沉默拟南芥AGO1基因产生的一系列突变表型
河南农业大学博士后Sachin Teotia和教师王潇然副教授为本论文共同第一作者，河南农业大学唐贵良教授，彭廷教授及王潇然副教授为论文共同通讯作者，河南农业大学研究生周娜、王萌萌、青年教师张战辉副教授也参与了该项工作。本研究得到国家自然科学基金支持（31571679；32070852；32272014）。
