为了快速筛选候选基因对再生能力的影响，研究者采用了使用组成型启动子驱动候选基因表达的转基因过表达方法。选择了三个候选基因进行进一步的测试，即Wox2a、 Gras23和 Gme1，而且所有这三个基因都在 A188未成熟合子胚胎组织培养的前72小时中表达。在筛选这些候选基因之后，利用玉米中的 F2双亲定位群体进行的遗传定位研究鉴定了几个用于组织培养反应和转化的 QTL，包括染色体3上含有Wox2a的一个 QTL 区域。这些结果进一步表明了 Wox2a 作为候选基因的可能性。进一步利用转基因过表达方法，研究发现 Wox2a的高水平组成型表达足以诱导B73基因型玉米未成熟合子胚外植体的体细胞胚胎发生。Gras23和Gme1的组成型表达不诱导体细胞胚胎发生。进一步的实验直接比较了 Wox2a-B73和 Wox2a-A188等位基因编码序列的功能，以确定诱导体细胞胚胎的能力是否存在差异。结果显示ZmUbi1: : Wox2a-B73和 ZmUbi1: : Wox2a-A188序列的两种载体均强烈地产生体细胞胚胎，另外研究者没有检测到这两个序列在诱导的体细胞胚胎发生的频率或强度上的显着差异（图2）。
图2、ZmUbi1: : Wox2a-B73二元载体处理 B73幼胚的研究
接下来的研究中，24株再生植株被移植到土壤中并在温室中生长以作进一步分析，其中18株存活下来。试管苗转入温室生长条件后，从叶片组织中分离到基因组 DNA。PCR 用于筛选再生体中报告基因的存在。独立产生的阳性T0植物的数量发生频率为载体FA13的4.5%和FA15的1.6% (图3a)。24株 B73的T0植株中有4株转基因植株检测呈阳性。有趣的是，FA15的单一阳性事件来自一个有三个T0再生体的外植体，而且三个外植体中只有一个是阳性。这些信息，加上在培养中不施加选择压力时再生的大量非转基因“逃逸”植物，表明Wox2a可以以细胞非自主的方式在附近的非转基因细胞中诱导体细胞胚胎发生。所有在温室过渡期存活下来的再生植株均生长成熟并自花授粉产生假定的 T1后代。对两株自花授粉的阳性T0植株产生的T1种子进行了检验发现分离比例与单拷贝半合子亲本一致。此外，代表独立事件的植物样本产生了 T1种子分离的比例为3:1的表达(图3b，c)。通过PCR 验证了干燥种子的表型(图3d)，结果表明，用ZmUbi1: : Wox2a-A188和 ZmUbi1: : Wox2a-B73载体转化的外植体产生的体细胞胚可再生并产生T0植株。再生植株表型正常，完全可育，从两个阳性植株自花授粉获得 T1种子分析表明T1后代也是表型正常的。
总的来说，研究者描述了一种基于正向遗传学的方法鉴定了一种能够诱导玉米体细胞胚胎发生、胚性愈伤组织形成和植株再生的基因集。在所检测的基因中，研究者鉴定了一个单一的候选基因：Wuschel-like homeobox protein 2a (Wox2a)，它可以诱导 B73体细胞胚胎形成和脆性、胚性、可再生愈伤组织的生长以及表型正常植株和后代的再生。
文章来源：植物生物技术Pbj
