随机突变是生物学研究中的一项强有力的技术，通过诱变所产生的遗传多样性通常用于蛋白质工程和合成途径优化。然而，目前的随机突变技术还不能允许在原生基因组中对特定的、可靶向的区域进行可诱导、连续的体内突变，同时具有足够大的活动窗口，以包含复杂的代谢途径，而不影响基因组的其他部分。

近日，Anna Zimmermann等在国际知名期刊《Nature Communications》上在线发表了一篇名为“A Cas3-base editing tool for targetable in vivo mutagenesis”的研究论文。该研究开发了一种允许对多达55kb的基因组位点进行体内诱变和靶向的CoMuTER工具，该工具使目标区域的突变数量增加了350倍，平均每kb有0.3个突变，具有可及性和靶向性，弥补了全基因组和狭窄局部诱变间的技术差距，是优化复杂生物合成途径的有效工具。

首先，该研究利用功能完整的Cas3、缺乏核酸酶活性的dnCas3，和两种胞苷脱氨酶pmcda1和rAPOBEC1，构建了四种不同的Cas3碱基编辑器融合结构，包括Cas3-APOBEC1、Cas3- CDA1、dnCas3-APOBEC1和dnCas3-CDA1。以未融合的野生型Cas3做对照，将含有crRNA和Cas3碱基编辑器的质粒或未融合Cas3的质粒转化为S288c-CB，用于来研究系统的功能（图1）。

图1.CoMuTER的原理与设计。

通过靶向CAN1基因测试不同Cas3碱基编辑器/未融合Cas3的突变活性，发现Cas3碱基编辑系统在酿酒酵母中是可诱导和有活性的，可以靶向到特定的目标位点，并且Cas3的核活性对各自碱基编辑器的目标位点特异性活性至关重要（图2）。

图2.CoMuTER导致靶向后CAN1敲除突变显著增加。

为了检测Cas3碱基编辑器的突变范围，该研究对分别对位于CAN1起始密码子下游68bp和上游675bp的两个目标位点的下游12kb区域进行了测序，发现只有Cas3-APOBEC1碱基编辑器引起了序列区域胞苷脱氨基的显著增加。碱基编辑器平均每kb引入0.35/0.26胞苷脱氨，目标位点1和2的突变频率分别为1000/736bp，引入的突变跨越了整个测序区域，表明至少有12kb的活动窗口（图3）。为了更好地观察目标窗口并检查脱靶突变的发生情况，该研究对整个序列进行了测序，发现所有Cas3碱基编辑器都导致了整个基因组胞苷脱氨基的显著增加，这与靶向无关，Cas3-APOBEC1碱基编辑器的总活性窗口约为37/55kb，突变频率在该区域的边缘附近逐渐减少(图4）。

图3.Cas3-APOBEC1基编辑器在目标位点下游12kb区域引入胞苷随机脱氨。

图4.Cas3-APOBEC1的双向活性可使目标区域的胞嘧啶脱氨基反应数量增加350倍。

Cas3-APOBEC1碱基编辑器具有在可定义的基因组区域内引入随机胞苷脱氨的扩展范围和能力，使其成为优化异源生物合成途径的一个有前途的工具。研究以插入酿酒酵母基因组的番茄红素合成途径为目标，测试了Cas3碱基编辑器的应用，发现在单轮诱变后酿酒酵母的番茄红素产量增加一倍，证明了CoMuTER途径优化的适用性。

图5.经过一轮诱变后，CoMuTER优化了番茄红素的产量。

文章来源：植物生物技术Pbj