近日，知名期刊Nature Communications 在线发表了题为“Spatial distribution of three ARGONAUTEs regulates the anther phasiRNA pathway”的研究论文。该研究在水稻花药中鉴定了两种AGO1b和AGO1d，它们与来源于大量长非编码RNA的phasiRNAs相互作用。此外，3D免疫成像和突变分析表明，水稻AGO1b和AGO1d细胞类型通过充当这些PhasiRNA从体细胞层到花药生殖细胞的移动载体，特异性地调节花药发育，揭示了AGO1b/d和MEL1三种AGO在水稻花药阶段RNA途径中的位点特异性调控。
为了阐明AGO1b和AGO1d的生殖作用，研究人员用CRISPR/Cas9系统对AGO1b和AGO1d进行了基因组编辑，获得ago1b-1、ago1d-3突变体，并通过授粉，获得双突变体ago1b-1 ago1d-3，与WT相比，ago1b-1 ago1d-3双突变体表现出严重的不育性。与野生型花药相比，ago1b-1 ago1d-3双突变体的花药更卷曲、更短，大小和形状也更多样。为了区分突变花药的内部结构，研究人员使用3D成像技术发现双突变体表现出正常的花药结构，但花药内部结构异常例如花粉粒在花药室的部分没有填充，一些颗粒被压碎等等，这些突变分析表明，AGO1b/d冗余地调节花药发育，从而影响花药壁发育过程中花粉的排列、填充和发育，这与生殖细胞特异性M E L 1的减数分裂进展功能不同。
图一 AGO1b和AGO1d突变引起花药发育异常的种子不育
使用花药的Wes表明，在0.4–0.9毫米花药发育的六个阶段中，AGO1b和AGO1d从减数分裂早期到减数分裂后期都富集，为了鉴定与AGO1b和AGO1d相互作用的small RNAs，研究人员对减数分裂前到减数分裂后0.4–0.9mm的花药进行了RIP，发现AGO1b和AGO1d主要与具有5′-末端尿嘧啶的21nt小RNA结合（U-phasiRNAs），此外，大多数AGO1b/d-smallRNAs被归类为来源于21PHASs的phasiRNAs，这是花药特异性lncRNA。
图二 21nt U-phasiRNAs与AGO1b和AGO1d的相关性。
接下来，研究人员使用PHASIS程序进行聚类分析，以检测21PHASs的基因组基因座，这是结合到AGO1b/d上的21nt相siRNA的起源，结果表明AGO1b和AGO1d的U-phasiRNAs亚群分离。为了研究花药中的这些AGO1b/d蛋白，我们在减数分裂早期使用整株花药对AGO1b和AGO1d进行了3D多重免疫染色。发现AGO1b和AGO1d均富集于细胞核和表皮细胞膜；在伸长的横隔室内细胞中，AGO1d在细胞核附近的细胞质中更丰富；在中间层的细胞中，AGO1b存在于细胞核中，在中层细胞的细胞质中检测到微弱的AGO1d荧光信号；AGO1b在绒毡层中的定位仅限于细胞核，而AGO1d同时存在于细胞核和细胞质中；此外，AGO1b主要在减数分裂早期的PMCs细胞核中检测到。
图三 AGO1b和AGO1d在U-phasiRNA sorting中的亚群分离
图四 细胞核AGO1b和细胞质AGO1d在体细胞和生殖细胞
研究人员接着对三种AGOs蛋白AGO1b/d和MEL1在花药中的空间和细胞内分布比较，AGO1b和AGO1d在体细胞花药壁细胞和PMCs中都很丰富，而MEL1仅限于生殖细胞、PMCs。
图五 AGO1b/d和MEL的空间和细胞内分布比较
研究人员进行了原位杂交（ISH）来研究AGO1b、AGO1d和MEL1在2–2.5毫米花序花药中的RNA定位， 研究发现AGO1b mRNA在药室内壁和花药壁中层中表达，但很少在绒毡层内层和PMCs中表达，但AGO1b除了定位于绒毡层细胞层外，还富含PMCs。同样，AGO1d定位在PMCs和花药壁中，而AGO1d mRNA在花药壁中特异性表达。AGO1b/d亚家族基因的mRNA和蛋白在花药中的不同定位表明，AGO1b和AGO1d从外层迁移到内层，PMCs作为phasiRNA的载体。
图六U-phasiRNA-carrying AGO1b/d作为从花药壁到PMCs的移动信号。
文章来源：植物生物技术Pbj
