2023年5月1日，中国农业大学园艺学院马超教授团队在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Developing a UV–visible reporter-assisted CRISPR/Cas9 gene editing system to alter flowering time in Chrysanthemum indicum”的研究论文。该研究利用CRISPR/Cas9 技术在菊花中实现基因编辑；并针对菊花基因编辑高度嵌合化的技术问题，构建 35S:eYGFPuv 荧光菊花，通过构建eYGFPuv 和目标基因敲除载体，以eYGFPuv荧光为marker，筛选基因编辑植株，显著提高了筛选效率并剔除嵌合体植株，建立了高效的菊花基因编辑技术体系。

菊花作为全球重要的观赏作物之一，具有重要的经济价值。菊花基因组高度复杂、杂合性强、以及自交不亲和性等因素，限制了菊花基础和应用研究。CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现定点编辑，快速对菊花进行遗传改良，在菊花基础研究和种质创新中有广阔的应用前景。但目前，基因编辑效率低，嵌合率高的问题一直限制基因编辑技术在菊花中的应用与发展。

为了解决上述问题，该研究选择了一种二倍体野菊（Chrysanthemum indicum）作为菊花模式植物，并针对CRISPR/Cas9基因编辑技术中的目标靶点、启动子、Cas9密码子进行了一系列的优化：1）在野菊中建立了原生质体转化系统，结合二代测序技术对目标基因Phytoene desaturase (CiPDS) 候选靶点进行筛选；2）对五个不同启动子驱动Cas9和sgRNA的效率进行了测试；3）基于拟南芥和野菊密码子使用偏好对Cas9进行了优化。

作者通过农杆菌介导的方法将九种载体转化到野菊中。结果表明，携带35S:AtCas9和PcUbi: sgRNA的载体在所有实验组中表现出最高的编辑效率，命名为pDIRECT-Ci-opti（图1c）。

进一步，作者发现在获得的白化植株中，嵌合体占比达到28.6%（图1d2,d3），高概率的嵌合性给菊花基因编辑的评估和筛选带来了巨大的障碍。为了进一步提高筛选效率并解决嵌合问题，该研究将UV下裸眼可见的eYGFPuv荧光基因转入野菊中（图1f）。以eYGFPuv作为可视标记来高效筛选基因编辑植株并消除嵌合性问题。将CiPDS sgRNA1和sgRNA2以及eYGFPuv sgRNA1和sgRNA2克隆到pDIRECT-Ci-opti中（pDIRECT-Ci-opti-CiPDS-eYGFPuv，图1g），并将该载体转入eYGFPuv转基因株系中。结果表明，与传统的抗生素筛选效率（16.0%）相比（图1i），利用eYGFPuv为marker筛选效率可达63.6%（图1i）。该研究使用突变的eYGFPuv作为可视标记，提高了筛选效率，并基本消除了嵌合植株（图1h）。

菊花的开花通常需要人工调节光周期。菊花育种的一个主要目标是创建光周期不敏感型（早花）菊花品种。在该研究中，作者在野菊中鉴定了两个TFL1同源基因：CiTFL1a和CiTFL1b。利用构建的CRISPR/Cas9体系，创制了三个Citfl1a双等位基因突变体和一个Citfl1b纯合突变体（图1j）。这些突变体植株表现出不同程度的早花表型。

该研究将荧光报告基因和CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，实现了快速、准确地检测基因编辑效果的目的。这一技术将为菊花的研究和育种提供了有力的支持，同时为其他领域的基因编辑研究提供了新的思路和方法。

中国农业大学园艺学院马超教授为通讯作者，博士研究生刘磊为论文第一作者。该研究得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金的支持。

文章来源：植物生物技术Pbj