转录因子研究套路（三）

2023年5月4日 0条评论 706次阅读 0人点赞

在先前的推文中，小远发现大家对转录因子相关的文章比较感兴趣，因此猜测应该很多人都在做这方面的研究，为了更好的帮助大家开展转录因子的研究，本次推文主要是和大家一起来复盘一下转录因子的常规研究思路及方法，内容可以归纳为如下：

在正式阅读之前我们先来回顾一下转录因子的相关概念，转录因子（Transcription factor，TF）也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。转录因子一般由DNA结合域、转录调控域（包括激活域或抑制域）、寡聚化位点以及核定位信号等4个功能区域组成。TF在植物生长发育和逆境防御反应等过程中具有重要调控作用，因此，对TF及其相互作用因子的功能研究对了解它们在信号级联反应中的作用至关重要。

转录因子筛选及分析

在进行转录因子的研究时，我们首先需要通过实验筛选目标转录因子，常用的方法有转录组测序（RNA-seq）、ATAC-seq、酵母单杂筛库等。在方法的选择上：（1）如果现有的研究基础较少且没有靶基因，可以选择用RNA-seq或ATAC-seq，当然也可以两种方法联合使用。RNA-seq是从整体组织或细胞的转录水平，系统研究基因的转录图谱，其测定的数据中除了转录因子的表达信息外，还有其它基因的测定结果；ATAC-seq则是在全基因组范围内检测染色质的开放程度，得到全基因组范围内蛋白质可能结合的位点信息，从而筛选感兴趣的特定转录因子（在实际应用中ATAC-seq通常会与其他测序如RNA-seq、ChIP-seq等，一起联用进行组合分析）。（2）如果现有的研究基础已经较为丰富，想通过靶基因筛选上游调控因子，那么就可以用现有基因的启动子序列通过酵母单杂筛库的方法来寻找与之结合的转录因子。筛选到候选的转录因子之后我们还可以利用生物信息学对其进行分析。尤其是在某些物种基因组注释没有那么透彻的情况下，对研究物种中某个转录因子家族基因进行全局鉴定也可以做为研究的方向。

1.1 转录组测序

转录组测序是对某一物种或特定细胞在某一功能状态下产生的mRNA进行高通量测序，既可以提供定量分析，检测基因表达水平差异，又可以提供结构分析，发现稀有转录本，精确地识别可变剪切位点、基因融合等。目前，RNA测序（RNA sequencing，RNA-Seq）技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。

文献举例

在“Comparative Transcriptome Analysis of the Climacteric of Apple fruit Uncovers the Involvement of transcription factors affecting ethylene biosynthesis”一文中，作者为了鉴定苹果果实贮藏过程中差异表达的转录因子，明确它们调控苹果果实贮藏过程中乙烯合成的模式。作者首先通过对跃变前（0-Pre），跃变后（15-Post）和1-甲基环丙烯（15-MCP）处理的苹果果实进行转录组测序分析（图1），从中鉴定到了多种差异表达的转录因子，包括MdAGL30、MdAGL104、MdERF008、MdNAC71、MdDof1.2、MdHSFB2a和MdHSFB3。接着通过Y1H、GUS报告基因和LUC报告基因以及苹果愈伤组织转基因等试验明确了筛选出的转录因子在果实乙烯合成中的调控作用。

图1 RNA-Seq筛选到的乙烯生物合成和信号转导相关差异基因相对表达的热图(Li et al., 2022)。

1.2 ATAC-seq

ATAC-Seq技术是一种研究表观遗传的创新型技术，它是一种在全基因组水平上通过高度活跃的Tn5转座酶切割DNA序列来检测染色质可及性的方法。通俗地讲，就是Tn5转座酶可以随机结合并切割染色质开放区的DNA，并且可同时在切割位点插入接头序列。只要将携带已知DNA序列标签的转座复合物加入到细胞核中一起孵育，再利用已知序列标签进行PCR扩增即可建成文库，经过测序就可以获得染色质开放区的信息了（图2）。ATAC所捕获的染色质开放区一般是正在转录的那部分DNA序列的上下游，得到这些序列我们就可以对富集到的序列结合motif分析，识别哪种转录因子参与了基因表达调控，通过ATAC-seq寻找出来的转录因子一般是全基因组内发挥关键作用的调控因子。除此之外，ATAC-seq在核小体定位、识别启动子区域、潜在的增强子或沉默子、绘制染色质开放图谱、寻找转录因子调控的靶基因等方面都具有广泛的应用。有关ATAC-seq的详细介绍，大家感兴趣的话可以查阅小远的往期文章“解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（一）”。

图2 ATAC-seq转座反应和文库制备示意图(Grandi et al., 2022)。（a）将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带红色和蓝色序列标签的Tn5转座酶）加入到细胞核中一起孵育；（b）再利用引物进行PCR扩增即可形成文库。（c）经过测序和分析就可以获得染色质开放区的信息。

文献举例

在“ATAC-seq and RNA-seq reveal the role of AGL18 in regulating fruit ripening via ethylene-auxin crosstalk in papaya”一文中，作者使用ATAC-seq和RNA-seq联合分析的方法，揭示了在木瓜成熟过程中用1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后不同时间的染色质可及性的差异，并挖掘出了在1-MCP处理下影响果实成熟的关键转录因子以及靶标基因。在研究过程中，作者首先使用ATAC-seq发现MADS转录因子参与木瓜果实成熟。接着通过ATAC-seq和RNA-seq联合分析的方法发现，CpAGL18（MADS）和生长素信号通路（CpWAT、CpSAUR32/50、CpPIN、CpTIR1）以及乙烯信号通路（CpEIL3、CpERF113和CpACS1）的相关基因在木瓜果实成熟过程中可能具有重要作用，整合ATAC-seq和RNA-seq的基因组可视化图谱表明CpAGL18和CpSAUR32以及CpACS1在1-MCP的不同处理下其表达量和关联染色质的开放性发生变化（图3）。最后，作者结合体内、体外实验证实了CpAGL18可以结合并激活CpACS1和CpSAUR32的表达，从而参与乙烯和生长素信号通路，进而影响木瓜果实的成熟。

图3 整合ATAC-seq和RNA-seq的基因组可视化图谱显示受1-MCP影响的基因表达差异以及这些基因关联的染色质的可及性变化(Cai et al., 2022)。红色和蓝色表示基因的表达差异，绿色和紫色表示基因关联的染色质可及性变化。

1.3 酵母单杂筛库

酵母单杂交是将DNA顺式作用元件作为诱饵，筛选靶元件特异结合的转录因子（cDNA）的有效方法。其原理是将包含感兴趣的DNA（通常被称为诱饵（Bait））和报告基因融合的诱饵载体，与包含感兴趣的转录因子（TF，通常被称为猎物（Prey））和酵母转录激活域（AD）融合的猎物载体都转入到合适的酵母菌株中，如果TF在酵母细胞核的环境中与Bait结合，那么AD就会诱导报告蛋白的表达。需要注意的是以文库的形式进行酵母单杂筛选后，其中阳性菌落必须进行测序和回转验证（图4）。

图4 Y1H分析的变化和注意事项概述(Sewell Jared A.and Juan I. Fuxman Bass, 2018)。利用限制性内切酶（RE）或Gateway技术将复杂调控区、转录因子结合基序或非编码变异的DNA序列克隆至报告基因上游。这些结构最常被整合至酵母基因组中以产生DNA诱饵菌株。然后将DNA诱饵菌株转化或与一组猎物克隆（ORF融合到Gal4的激活结构域AD上）Mating。编码猎物的载体可以是低拷贝或高拷贝的。筛选除了以文库进行筛选外，也可以以阵列的形式进行筛选，阳性菌落的位置表明相互作用的转录因子（TF）的信息。

文献举例

在“Construction of yeast one-hybrid library and screening of transcription factors regulating LhMYBSPLATTER expression in Asiatic hybrid lilies (Lilium spp.)”一文中，作者为了研究LhMYBSPLATTER直接相关调控蛋白在花青素色素沉着中的分子机制，构建了酵母单杂交（Y1H）cDNA文库。通过重组诱饵质粒筛选出了7种猎物蛋白（候选转录因子），分别为BTF3、MYB4、IAA6-like、ERF4、ARR1、ERF WIN1-like和ERF061。之后作者验证转录因子与LHMYBsplater启动子的相互作用时发现，ERFs、AUX/IAA和BTF3可能参与百合花青素生物合成途径的负调控。

表1 转录因子筛选结果(Cao et al., 2022)。

1.4 生物信息学分析

大多数转录因子的序列具有保守性，这些保守结构域使得用生物信息学方法进行转录因子的分析成为可能。DNA结合结构域（BD）是转录因子最主要的保守区域，其次还有转录激活域（AD）或转录抑制域（RD），在漫长的进化过程中，这些区域的氨基酸序列变化都很小，确保了转录因子功能的准确行使。利用生物信息学分析可以快速分析筛选到的转录因子的核心区域、信号肽、蛋白的糖基化位点、磷酸化位点、蛋白激酶结合位点和蛋白亲/疏水性等，在此为大家简单列举一些常用的网站（具体使用方法大家可以查阅相关的网址使用介绍，小远在此就不再展开讲解了）：

（1）蛋白功能结构域预测：MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）；

（2）信号肽序列分析网站：SignaIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；

（3）蛋白的糖基化位点、磷酸化位点和蛋白激酶结合位点预测网站：NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）；

（4）蛋白亲/疏水性分析网站：

ExPasy-ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）；

（5）蛋白质二级结构预测网站：

SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）。

转录因子验证

利用上述实验方法筛选到核心转录因子后，接下来一般需要对转录因子进行进一步的验证，明确其确实是转录因子后，再开展后续的研究。那么如何验证一个基因是转录因子呢？常用的方法有亚细胞定位以及转录激活分析等，小远在此就简单给大家介绍一下相关的内容，感兴趣的小伙伴还可以查阅小远的往期推文“最强大脑炼成记——如何验证一个基因是转录因子”。

2.1 亚细胞定位

转录因子只有在细胞核中才能发挥其功能，因此通过研究亚细胞定位情况，在一定程度上可以验证其是否为转录因子。利用生物信息学技术虽然可以根据氨基酸序列分析来预测蛋白质的亚细胞定位（表2），但不同的计算方法可能会得出不同的预测结果，因此最终的结论必须要通过实验来验证。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是将绿色荧光蛋白（GFP）或其衍生蛋白等报告基因，与目标基因融合在一起，由目标蛋白的引导信号进行亚细胞定位，对报告蛋白的光信号进行跟踪和观察，从而确定目标蛋白的定位。

表2 蛋白质亚细胞定位的部分预测软件和网站(Donnes and Hoglund, 2004)。

文献举例

在“Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis”一文中，TaWRKY1和TaWRKY33作为干旱WRKY转录因子，它们的亚细胞定位结果都定位在细胞核中（图5），这个结果符合我们对转录因子的一般认识。但是转录因子定位在细胞核中并不是一个绝对的结论，还存在一些特殊案例，例如，bHLH039作为一个转录因子，单独转化烟草细胞或拟南芥原生质体时，其亚细胞定位都没有显示完全的细胞核定位。在烟草叶片细胞中，bHLH039主要定位在细胞质中，而在拟南芥原生质体中，bHLH039在细胞核和细胞质都有比较明显的信号(Trofimov et al., 2019)。所以，遇到亚细胞定位不在细胞核中的情况时不要慌，我们还可以通过转录激活分析来验证哦。

图5 TaWRKY1和TaWRKY33蛋白的亚细胞定位(He et al., 2016)。

2.2 转录激活分析

酵母实验系统与双荧光素酶检测系统都可以检测转录因子的转录激活活性，前者是以β-半乳糖苷酶的活性来衡量，后者则是以荧光素酶活性来衡量。酵母实验系统就是将需要验证的转录因子构建到BD载体上，不需要构建AD载体，如果转录因子具有转录激活活性，那么下游的报告基因就能被激活表达，这样也就验证了转录因子是具有转录激活活性的。而双荧光素酶检测系统则将GAL-TATA插入报告基因载体，同时将转录因子连入BD载体与报告基因载体进行共转，结合荧光素酶的检测结果来分析转录因子是否有转录激活能力（图6）。

图6 分析转录因子转录激活时的载体构建原理图。图片来源：伯远生物科研绘图团队。

文献举例

在“Coexpression network analysis reveals an MYB transcriptional activator involved in capsaicinoid biosynthesis in hot peppers”一文中，作者为了验证CaMYB48的转录激活活性，在酵母和植物中分别进行了活性检测。酵母实验表明CaMYB48蛋白具有很强的激活活性，作者基于保守区域分析进一步确认了aa168-191对CaMYB48的激活活性必不可少。双荧光素酶报告基因检测同样表明CaMYB48在本氏烟草中具有转录活性，进一步分析表明，C端酸性氨基酸区域负责执行CaMYB48的转录活性（图7）。

图7 CaMYB48转录因子结构及转录激活活性分析(Sun et al., 2020)。（a）CaMYB48结构域的示意图。（b）酵母中CaMYB48的转录激活分析。（c）在植物中CaMYB48的转录激活分析。

转录因子功能研究

验证完转录因子之后，接下来就要正式进入转录因子的功能研究了，主要包括两个方面：（1）转录因子基因的表达量，因为转录因子基因的表达具有时空特异性，可以根据其在不同组织或生命过程中的高表达来推测其相关的功能。此外，如果是通过转录组测序筛选到的转录因子，通过定量分析可以进一步检验转录组数据的准确性。（2）转录因子的经典基因功能验证，可以通过过表达、敲除基因，结合表型来推测其功能。

3.1 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。在转录因子研究过程中，常被用于检测转录因子基因的表达情况。

文献举例

在“JrWRKY21 interacts with JrPTI5L to activate expression of JrPR5L for resistance to Colletotrichum gloeosporioides in walnut”一文中，作者通过将转录组数据与NCBI数据库的比较，鉴定出了42个WRKY转录因子基因，并通过对这些基因的表达水平进行聚类分析进一步筛选出了9个差异表达基因。为了对结果进行确认，作者通过RT-qPCR对这9个编码WRKY转录因子的基因的表达进行验证，发现这些基因的差异表达模式与转录组数据的差异表达模式一致（图8）。其中，编码WRKY21的基因的表达差异最为显著。因此，作者将JrWRKY21作为分析的靶基因进行了后续实验。并最终揭示了JrWRKY21通过与JrPTI5L相互作用促进病程相关蛋白PR5L的表达，进而提高核桃抗炭疽病能力的分子机制。

图8 9个WRKY基因在抗性（L423）和敏感性（L37）核桃叶片中的相对表达量(Zhou et al., 2022)。

3.2 过表达、敲除

借助农杆菌或者基因枪等方法，将构建好的转录因子过表达载体（构建时需要对转录因子基因进行克隆）以及基因编辑载体，稳定的转入所研究的物种中，获得转基因苗后，可以对其进行进一步的实验分析，从而推测转录因子的功能。而在实际的研究过程中如果遇到所研究的物种没有成熟的遗传转化体系时怎么办呢？不要慌，小远在先前的推文中已经给大家总结过解决办法了，感兴趣的小伙伴可以查阅：“没有转化体系的物种，如何研究其基因功能？（一）”、“没有转化体系的物种，如何研究其基因功能？（二）”、“没有转化体系的物种，如何研究其基因功能？（三）”。

文献举例

在“Knock out of transcription factor WRKY53 thickens sclerenchyma cell walls, confers bacterial blight resistance”一文中，作者发现OsWRKY53的表达主要由损伤诱导，而水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo）的侵染可以抑制OsWRKY53的表达，为了研究WRKY53在响应Xoo中的功能，通过OsWRKY53过表达株系和敲除株系对Xoo抗性的研究发现，相比对照WT，过表达株系更易染病，而敲除株系更加抗病，由此证明OsWRKY53负调控水稻对Xoo的抗性（图9）。

图9 OsWRKY53负调控水稻对白叶枯病（Xoo）的抗性(Xie et al., 2021)。（A）Xoo接种后OsWRKY53的转录模式。hpi，接种后数小时。（B）损伤处理或接种Xoo后OsWRKY53的相对转录水平。（C）损伤处理和接种Xoo处理下oswrky53调控的LUC的活性。（D）OsWRKY53-oe株系中OsWRKY53的相对转录水平和叶片病变长度。（E）oswrky53突变体对Xoo（PXO347菌株）的反应。（F）Xoo感染后OsWRKY53-oe和oswrky53植株的表型。（G）oswrky53突变体对不同Xoo菌株的反应。

转录因子机制解析

研究完转录因子的基本功能之后，接下来就可以继续解析相关机制了。主要可以从两个方面来着手：（1）转录因子与特异性DNA结合调节转录；（2）转录因子与其它蛋白互作完成功能。

4.1 筛选转录因子特异性结合的DNA序列

利用经典的蛋白和DNA互作的研究手段（如，ChIP-seq、CUT–Tag以及DAP-seq）可以鉴定出转录因子结合的DNA序列是什么。获得结合的DNA序列后可以利用EMSA、酵母单杂、双荧光素酶等实验进一步证明转录因子确实可以与筛选到的DNA序列结合来完成转录调控。

4.2 筛选转录因子的互作转录因子或其它蛋白

转录因子基因自身的表达也可能受到其它调节因子的调控。和其它基因一样，转录因子基因的编码区上游含有各种顺式调控元件来接收调控因子的作用。因此，通过转录因子启动子顺式元件分析、酵母单杂筛库可以筛选出转录因子的上游调控蛋白（转录因子），筛选完成后可以结合酵母单杂点对点实验、亚细胞定位及转录激活分析来对其进行验证。除了筛选转录因子的上游调控蛋白（转录因子）之外，还可以通过IP-MS来筛选转录因子的其它互作蛋白，筛选完成后可以结合Co-IP、GST pull-down、BiFC实验来对互作蛋白进行验证。通过上述实验思路就可以搭建出转录因子的调控网络了。

小远叨叨

文章至此就先告一段落了！因为篇幅有限，所以有关转录因子机制解析的相关内容，在之后的推文中再与大家详细探讨。最后，让我们一起再来回顾一下转录因子研究的整体思路吧：首先大家可以通过组学技术或酵母单杂筛库筛选出候选的转录因子；接下来可以通过生物信息学对转录因子的身份信息进行初步确认，并结合亚细胞定位、转录激活分析明确转录因子的身份；随后可以对其表达模式进行研究，并结合过表达和敲除的表型差异推测其功能，最后通过鉴定与之结合的DNA序列以及互作蛋白，综合解析其作用机制，构建出转录因子的调控网络。这样一套常规的研究路线就算完成了。当然，在实际的研究中，大家可以在这个常规套路的基础上结合自己的研究特点进行相应的删减。同时，由于转录因子功能的复杂性，大家还可以在研究过程中补充其它的研究方法哦。最后，希望大家在研究转录因子的过程中都能取得丰硕的成果！

References：

Cao Y, Bi M, Yang P, et al. Construction of yeast one-hybrid library and screening of transcription factors regulating LhMYBSPLATTER expression in Asiatic hybrid lilies (Lilium spp.). BMC Plant Biol. 2021, 21(1): 563.

Cai J, Wu Z, Song Z, et al. ATAC-seq and RNA-seq reveal the role of AGL18 in regulating fruit ripening via ethylene-auxin crosstalk in papaya. Postharvest Biology and Technology. 2022, 191.

Dönnes P, Höglund A. Predicting protein subcellular localization: past, present, and future. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2004, 2(4): 209-215.

Grandi FC, Modi H, Kampman L, et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 2022, 17(6): 1518-1552.

He GH, Xu JY, Wang YX, et al. Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis. BMC Plant Biol. 2016, 16(1): 116.

Li T, Zhang X, Wei Y, et al. Comparative Transcriptome Analysis of the Climacteric of Apple fruit Uncovers the Involvement of transcription factors affecting ethylene biosynthesis. Horticultural Plant Journal. 2022.

Sewell JA, Fuxman Bass JI. Options and considerations when using a yeast one-hybrid system[M]//Two-Hybrid Systems. Humana Press, New York, NY, 2018: 119-130.

Sun B, Zhou X, Chen C, et al. Coexpression network analysis reveals an MYB transcriptional activator involved in capsaicinoid biosynthesis in hot peppers. Hortic Res. 2020, 7(1): 162.

Trofimov K, Ivanov R, Eutebach M, et al. Mobility and localization of the iron deficiency-induced transcription factor bHLH039 change in the presence of FIT. Plant Direct. 2019, 3(12): e00190.

Xie W, Ke Y, Cao J, et al. Knock out of transcription factor WRKY53 thickens sclerenchyma cell walls, confers bacterial blight resistance. Plant Physiol. 2021, 187(3): 1746-1761.

Zhou R, Dong Y, Liu X, et al. JrWRKY21 interacts with JrPTI5L to activate the expression of JrPR5L for resistance to Colletotrichum gloeosporioides in walnut. Plant J. 2022, 111(4): 1152-1166.

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