田间作物的病害快速检测，有利于及时的诊断、监控以及控制病原体的蔓延，促进作物的健康生长，同时在植物检疫性病害的防控中起到重要作用。目前基于PCR的常规病原体检测方法，操作复杂耗时，需要借助昂贵的仪器设备。近几年，基于Crispr/LbCas12a蛋白的检测技术在分子诊断领域得到了广泛应用，该技术的原理是通过特异性识别病原物核酸序列，激活Cas蛋白对ssDNA荧光探针的乱切活性，从而实现在田间对病毒和病原菌的可视化检测。虽然现有的Cas12a核酸检测已经发展成为灵敏（aM级）特异的诊断方法，但是在检测时间、反应温度方面仍需进一步完善。
近日，河南农业大学冯建灿/郑先波团队的焦健研究组在植物学权威期刊《Plant BiotechnologyJournal》在线发表了题为《The engineered CRISPR-Mb2Cas12a variant enables sensitive and fast nucleic acid-based pathogens diagnostics in the field》的论文。该研究系统评价了来源于16种微生物的Cas12a同源蛋白，重点关注它们的反式裂解活性及其作为病原菌诊断酶的潜力。研究发现Mb2Cas12a具有比其他Cas12a酶更强的反切活性，更适合于室温下的反应温度，因此具有进一步开发成为诊断试剂酶的潜力。
图1 Mb2Cas12a-RRVRR变异蛋白的活性分析
通过同源比对和基因定点突变，将D172R, N563R, K569V, N573R 和 K625R五个突变位点引入Mb2Cas12a蛋白，构建Mb2Cas12a-RRVRR突变体（图1A）。研究发现Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白的旁切活性高于野生型蛋白（图1B-C），并且能够识别更广泛的PAM序列，从而便于靶标位点的设计和选择。
图2 基于Mb2Cas12a-RRVRR蛋白诊断平台
研究进一步发现，Cas12a蛋白与等温扩增（RPA）结合后的“一步法”诊断流程，可能会使得Cas12a/crRNA二元复合体丧失区分靶标序列SNP的能力，从而降低检测技术的特异性。因此，作者推荐使用“两步法”诊断流程，并通过3D打印设计了一个反应容器（图2E），在保持封闭系统的同时，物理分离RPA和Cas12a步骤。这种隔离但封闭的系统使诊断更加敏感和特异性，并有效地防止污染。凭借Mb2Cas12a-RRVRR突变体作为诊断酶，在体温加热情况下，可以在15min内检测细菌病原体（火疫病原菌和西瓜细菌性果斑病原菌）、植物RNA病毒（苹果ApNMV病毒）和转基因作物，表现出与qPCR相同或更高的敏感性（图2F）。总的来说，该研究结果进一步提高了目前基于CRISPR的诊断系统的效率，在多种样本类型的高灵敏度和特异性检测方面具有一定的应用潜力。
河南农业大学园艺学院青年教师焦健（校聘教授）为该研究第一作者，研究生刘一琪和杨孟莉参与部分工作，郑先波教授和冯建灿教授为共同通讯作者，中国农业科学院郑州果树研究所刘崇怀研究员，张恒涛研究员以及北京大学现代农业研究院叶文秀研究员参与本项研究。该工作得到了国家自然基金（31801818），河南省重大科技专项（212102110113），河南省高等学校重点科研项目（23A210019），河南省大宗水果产业体系（Z2014-11-3）以及河南农业大学“拔尖人才”项目的资助。
