杂交作物如何通过自交获得克隆种子?

伯小远去年在“袁隆平爷爷心系的‘一系法’,能否实现?”这篇文章中,介绍了“无融合生殖”的概念、实现的路径以及研究进展,最近,这个领域又有了新进展,下面就和伯小远一起来了解一下吧。

首先,咱们先来回顾一下概念,无融合生殖(Apomixis),是一种无性生殖方式,其后代不需要经过有性生殖而是直接由母本产生,后代会与母本具有相同的遗传物质,能够继承母本的优良性状并稳定遗传。无融合生殖广泛存在于460科开花植物的至少78个科中 (Xiong et al., 2023),例如禾本科、菊科、芸香科、蔷薇科、野牡丹科、毛茛科等 (Fei et al., 2019)。

无融合生殖的发育过程又是怎样的呢,和有性生殖中的双受精有什么不同?

这个问题我们可以从它的分类来了解。根据胚胎发育的来源即它是通过配子体(胚囊)还是直接从胚珠内的二倍体体细胞(孢子体)发育而来,可以将无融合生殖分为配子体无融合生殖孢子体无融合生殖(图1)。这部分知识比较难理解,大家了解即可,不影响理解后面的研究进展喔。

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图1 有性生殖、无融合生殖的胚胎发育过程(Fei et al., 2019)。(a)有性生殖过程,即双受精过程,大孢子母细胞经过有丝分裂形成一个含有8个核的胚囊,然后在双受精后形成胚胎;(b)配子体无融合生殖中的二倍体孢子生殖,大孢子母细胞进行有丝分裂形成未减数的胚囊,无融合生殖起始细胞起源于大孢子母细胞所在位置,最终发育成胚胎;(c)配子体无融合生殖中的无孢子生殖,靠近大孢子母细胞的无孢子初始细胞,形成未减数的囊胚,经过三轮有丝分裂,最终发育成胚胎;(d)孢子体无融合生殖,无融合生殖的起始细胞来源于胚珠,胚珠迅速分裂然后侵入胚囊,产生单个胚甚至多胚,孢子体无性生殖可与有性生殖共存。

配子体无融合生殖指胚胎在未经减数分裂产生的胚囊内形成,根据胚囊的来源又可以分为二倍体孢子生殖和无孢子体无融合生殖。二倍体孢子生殖是由大孢子母细胞经有丝分裂形成胚囊,由二倍体的卵细胞直接发育成胚胎。无孢子体无融合生殖是由胚珠中的体细胞经过有丝分裂形成胚囊,由胚囊内的无孢子生殖初始细胞分化形成胚胎。在菊科、蔷薇科和禾本科中常见。

孢子体无融合生殖是胚珠中的生殖细胞经过减数分裂和有丝分裂形成胚囊,再由珠被或珠心的体细胞分化形成不定胚。在柑橘属、芒果属、苹果属中常见。

无融合生殖虽然广泛存在于自然界中,但主要的农作物中不存在天然的无融合生殖现象。国内外学者对无融合生殖现象涉及的基因、机制和胚胎发育等进行了深入研究,涉及到例如高粱、蒲公英、柑橘、苹果、甜菜、花椒等物种,早期培育无融合生殖材料的主要方式是将无融合生殖的关键基因导入到目标物种中,但在主要作物中一直未能成功导入。

对于拥有子代杂种优势的作物来说,无融合生殖可以固定杂种优势,相当于在生产时直接制造出克隆种子,可以免去杂交制种的繁琐步骤。这个设想在上世纪30年代就已经被提出,被誉为农业上的一大圣杯,然而,受限于技术的原因,直到最近十几年,这个领域才开始涌现出重要的研究成果。

那么,如果我们想通过无融合生殖技术来进行杂种一代制种,到底如何实现呢?

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图2 有性生殖和无融合生殖在植株水平和染色体水平上的比较 (Xiong et al., 2023)。(a)F1杂种植物由两个亲本杂交产生,具有优于两个亲本的品质,然而,这种特性只存在一代,若F1代进行自交即有性生殖(左),经过重组后产生高度可变的后代群体,若经过无融合生殖(右),则会产生具有相同优良性状的无性系;(b)无融合生殖的关键步骤示意图:通过MiMedyad形成无减数分裂的克隆配子,再通过基因组消除或孤雌生殖跳过受精步骤。

目前在作物中实现的工程化无融合生殖的路径可归类于将有性生殖转变为配子体无融合生殖过程:抑制大孢子母细胞减数分裂,诱导有丝分裂,通过调节基因诱导大孢子母细胞发育成二倍体孢子,从而绕过授粉并启动具有与母体相同基因组成的胚胎的直接发育(图2)。

下面,我们来具体看看进展吧。

MiMe材料

首先,我们需要让植物母细胞的减数分裂转变为有丝分裂,产生可育的二倍体克隆配子。Raphaël Mercier团队实现了这个设想,他们找到了拟南芥的3个关键基因OSD1SPO11-1REC8,在这3个基因的三突变体(也被称为MiMe基因型,MiMe是Mitosis instead of Meiosis的缩写,指有丝分裂代替减数分裂)中,母细胞的减数分裂被有丝分裂取代 (d’Erfurth et al., 2009),这样的话,母细胞产生的就是二倍体配子。拟南芥中MiMe材料的创制为在其他物种中产生二倍体配子奠定了非常良好的基础。

后来,在水稻中通过杂交的方式获得了OSD1REC8、PAIR1三基因突变体材料OsMiMe,其也可以产生二倍体克隆配子 (Mieulet et al., 2016)。

MiMe材料也存在一个问题,其双受精过程未受影响,因此其子代每繁殖一代就会增加一倍的染色体数量。

因此,如何让有丝分裂与后续发育过程配合默契,生产出染色体不再加倍的子代呢?目前有两种方式,一种是,让亲本一方的染色体在杂交之后消亡,这样就能使后代染色体不再加倍了;另一种是,由二倍体配子独自激活胚胎发育即孤雌生殖过程(图3)。

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图3 无融合生殖的实现路径。图片来源:伯远生物科研绘图团队。a所述即为本小节中提到的MiMe材料繁殖后染色体会加倍的原因;b所述的方法即为下文中“OsMiMe+MTL”的方法;c所述的方法即为下文中“OsMiMe+BBM1”、“OsMiMe+BBM4”的方法。

MiMe+GEM

对于第一种方式,Raphaël Mercier团队真的找到了这种材料——GEM株系,该株系为CENH3基因突变株系(关于CENH3基因的详细内容可查阅文章“单倍体诱导技术(二)”)。将GEM株系作为父本,与MiMe株系杂交,后代中会产生二倍体种子,其来自父本的染色体会消亡,这样就解决了MiMe的子代染色体在自交后会加倍的问题(图4) (Marimuthu et al., 2011)。大家也会发现,此时,还未实现仅通过自交就能获得克隆种子的想法,用此方法生产二倍体种子为不同株系杂交所得。

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图4 在拟南芥中创制克隆种子的原理 (胡风越等, 2022)。

OsMiMe+MTL

再后来,得益于基因编辑技术的发展以及单倍体诱导技术的研究,中国水稻研究所王克剑团队和Raphaël Mercier团队合作在水稻中编辑了三个减数分裂关键基因REC8PAIR1OSD1和参与受精的MTL基因(关于MTL基因的详细内容可查阅文章“单倍体诱导技术(一)”)共四个内源基因(图5) (Wang et al., 2019),得到了Fix基因型植株,Fix株系的结实率为3.7%-5.2%,自交后其后代中二倍体子代占比4.7%-9.5%,其余为四倍体。至此,科学家们成功的通过自交获得克隆种子,实现了杂种优势的固定。这种方法同上,也是上述生产出二倍体子代的第一种方式。下一步,无融合生殖技术需要解决结实率低以及后代中二倍体占比低的问题。

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图5 在杂交水稻CY84中创制克隆种子的原理,MTL基因的突变可能会引起雄配子发育过程中染色体的碎片化 (胡风越等, 2022)。

OsMiMe+BBM1

有一个重要的研究不容我们忽视,在之前的文章中伯小远也有提到过,今天我们再重新了解一下,因为这篇文章的结果与最新的无融合生殖研究进展息息相关,并且这也是上文中提到的生产二倍体子代的第二种方式。

2019年,Venkatesan Sundaresan和Raphael Mercier团队在Nature杂志上发表了题为“A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds”的文章,该团队发现,异位表达BBM1基因并且敲除MiMe相关的三个基因得到的材料可以诱导产生克隆种子(图6) (Khanday et al., 2019)。

BBMBABY BOOM)基因,属于AP2/ERF(APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR)转录因子家族,之前的研究显示在拟南芥和油菜中异位表达BBM基因可以诱导体细胞胚,在本研究中,该团队在水稻中使用拟南芥卵母细胞特异性启动子pDD45驱动BBM1基因(此材料称为BBM1-ee),可实现未受精条件下合子的发育即孤雌生殖。基于此发现,该团队将BBM1-ee材料中的REC8PAIR1OSD1三个基因也敲除掉,结果显示,T0株系结实率显著下降,但得到了约11%-29%的二倍体子代,其余为四倍体子代。

备注:由于拟南芥特殊的浸花转化方法,拟南芥卵母细胞特异性启动子pDD45pEC1.2等目前也常用作拟南芥基因敲除实验中,使用它们驱动Cas9蛋白,保证Cas9蛋白只在卵母细胞和合子早期表达,避免拟南芥敲除苗产生嵌合体。

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图6 在水稻Kitaake中创制克隆种子的原理 (胡风越等, 2022)。

OsMiMe+BBM1(置于同一个T-DNA上)

2022年12月27日,Emmanuel Guiderdoni、Venkatesan Sundaresan、Raphael Mercier和Imtiyaz Khanday团队在Nature Communications杂志上发表了题为“High-frequency synthetic apomixis in hybrid rice”的文章,该团队发现,和前述不同的T-DNA载体设计,可实现无融合生殖95%以上的克隆效率,并在T3代中也保持表型上的稳定 (Vernet et al., 2022)。

该团队选择商业F1杂交水稻BRS-CIRAD 302作为受体材料,设计了三种载体来分别进行转化:T313载体(sgMiMe)为基因敲除载体,敲除OSD1REC8、PAIR1三个基因;T314载体(sgMiMe_pAtECS:BBM1 )除了含有敲除上述三个基因的转录单元,还另有一个使用卵母细胞特异性启动子pEC1.2驱动BBM1基因的转录单元;T315载体(sgMiMe_pOsECS:BBM1)与T314载体的区别在于驱动BBM1基因的卵母细胞特异性启动子被替换为了水稻中ECA1.1基因的启动子,而它是拟南芥EC1.2基因的同源基因(图7A)。

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图7 转化T314和T315载体后,对植物倍性和基因型的检测 (Vernet et al., 2022)。(A)T313、T314、T315载体结构示意图;(B)在MiMeMiMe+BBM1植物中形成四倍体和二倍体克隆后代的原理;(C)流式细胞仪检测倍性;(D)全基因组测序鉴定。

在T0代的T313、T314、T315中分别鉴定出了4、10、18株三纯合突变体:4株T313的后代均为四倍体;10株T314的后代中,有9株产生了超过80%的二倍体后代;在18株T315的后代中,有13株产生了超过80%的二倍体后代(表1)。其中,有几个株系的二倍体后代比率甚至超过了97%。这与上文中T0株系产生11%-29%的二倍体子代概率相比,有了极显著的提高,而这种效率的差异来自于载体结构的差异。

对这些二倍体的后代继续研究,结果显示,杂交性状在连续两代中都会得到保留,没有明显的负面影响(图8)。不可忽略的一点是,虽然二倍体子代占比很高,但无融合生殖植株的平均结实率为27%-35%,是对照BRS-CIRAD 302 F1的60-80%。

表1 检测筛选出的T0代T313、T314、T315的后代倍性 (Vernet et al., 2022)。

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图8 在本研究中发生无融合生殖事件的植株,其后代的表型、穗育性和籽粒质量 (Vernet et al., 2022)。(A)左图:杂交稻BRS-CIRAD 302的F1代、来自BRS-CIRAD 302自花授粉的5株F2代;右图:杂交稻BRS-CIRAD 302的F1代、来自T314 15.1的3株T1后代;(B)BRS-CIRAD 302 F1代,与T314 15.1、T314 37.7、T315 5.4、T315 8.1的5-6个T2进行比较;(C)BRS-CIRAD 302 F1代,与T314 15.1 T2的穗进行比较;(D)BRS-CIRAD 302 F1代,与T314 15.1、T314 37.7、T315 5.4、T315 8.1 T2种子灌浆率的比较;(E)上:1F亲本、D24亲本、BRS-CIRAD 302杂交F1、F2代的种子和去壳种子;下:T314 15.1、T314 37.7、T315 5.4、T315 8.1 T3种子和去壳种子;(F)BRS-CIRAD 302 F2种子和T314 15.1、T314 37.7、T315 5.4、T315 8.1 T3种子的淀粉和直链淀粉含量比较。

OsMiMe+BBM4(置于同一个T-DNA上)

2023年1月6日,中国水稻研究所王克剑团队在Molecular Plant杂志上发表了题为“Synthetic apomixis with normal hybrid rice seed production”的文章,该团队发现,同时敲除OSD1REC8、PAIR1三个基因并异位表达BBM4基因得到的Fix2植株可实现80.9%-86.1%的高结实率 (Wei et al., 2023)。

在水稻中,四个BBM基因具有不同的表达模式,除了BBM1之外,其他的三个基因是否可以诱导孤雌生殖呢?在本研究中,以杂交水稻春优84(CY84)为受体材料,使用拟南芥卵母细胞特异性启动子pDD45分别异位表达BBM2BBM3BBM4基因,发现只有异位表达BBM4基因可以诱导孤雌生殖(图9)。

《杂交作物如何通过自交获得克隆种子?》

图9 具有无融合生殖现象的高育性杂交水稻 (Wei et al., 2023)。(A)异位表达BBM2BBM3BBM4基因的载体结构示意图,转化后的植株分别被命名为EE-BBM2EE-BBM3EE-BBM4;(B)EE-BBM2EE-BBM3EE-BBM4植株的结实率和倍性水平分析;(C)CY84和EE-BBM4植株的株型和穗;(D)对四个单倍体进行全基因组测序,以杂交水稻CY84的两个亲本16A和C84为对照;(E)流式细胞仪检测EE-BBM2EE-BBM3EE-BBM4植株子代的倍性;(F)EE-BBM4的二倍体和单倍体后代的株型和穗;(G)同时敲除OSD1REC8、PAIR1三个基因并异位表达BBM4基因的载体结构示意图;(H)CY84和Fix2在株型和穗上的比较;(I)CY84和Fix2的结实率比较;(J)Fix2后代的倍性检测;(K)CY84和无性系Fix2在株型和穗上的比较;(L)CY84和无性系Fix2的结实率比较;(M)无性系Fix2的全基因组测序。结果显示,无性系Fix2在遗传上与对照CY84相同。

之后,构建载体sgMiMe_pDD45:BBM4,即同时敲除OSD1REC8、PAIR1三个基因并异位表达BBM4基因,转入CY84后,得到6株三基因纯合突变同时异位表达BBM4的材料Fix2,其表现出正常的形态和很高的结实率(80.9%-86.1%),来自Fix2植株的156、152和169个后代中,分别有2、2、4个被鉴定为二倍体植株,其余为四倍体植株。所以,该研究虽然使杂交水稻拥有很高的结实率,但不可忽略的是,其二倍体子代占比较低(1.3%、1.3%、2.4%)。

小远叨叨
在自然界中,无性生殖并不利于进化,因为它不会促进新基因在种群中的繁殖,同时还会减少种群的遗传多样性。但如果将植物设计成可控的无性生殖植株,在农业上对提高种子的质量、降低种子生产成本、稳定产量等方面都将产生广泛而深远的影响。就目前来说,我们还未得到结实率高且二倍体子代占比也高的工程化无融合生殖方法,但小远相信在不久的将来,通过对新基因的应用以及对载体的改良,一定会实现这个小目标,最终助力无融合生殖技术在农业生产上的应用!

References:

胡风越, 黄勇, 王克剑, 2022. 无融合生殖固定杂种优势的研究进展和展望. 中国基础科学

D’erfurth I, Jolivet S, Froger N, Catrice O, Novatchkova M, Mercier R, 2009. Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol 7, e1000124.

Khanday I, Skinner D, Yang B, Mercier R, Sundaresan V, 2019. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature 565, 91-5.

Fei X, Shi J, Liu Y, Niu J, Wei A. The steps from sexual reproduction to apomixis. Planta. 2019;249(6):1715-1730. doi:10.1007/s00425-019-03113-6

Marimuthu MP, Jolivet S, Ravi M, et al., 2011. Synthetic clonal reproduction through seeds. Science 331, 876.

Mieulet D, Jolivet S, Rivard M, et al. Turning rice meiosis into mitosis. Cell Res. 2016;26(11):1242-1254. doi:10.1038/cr.2016.117

Vernet A, Meynard D, Lian Q, et al. High-frequency synthetic apomixis in hybrid rice. Nat Commun. 2022;13(1):7963. Published 2022 Dec 27. doi:10.1038/s41467-022-35679-3

Wang C, Liu Q, Shen Y, et al., 2019. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat Biotechnol 37, 283-6.

Wei X, Liu C, Chen X, et al. Synthetic apomixis with normal hybrid rice seed production [published online ahead of print, 2023 Jan 5]. Mol Plant. 2023;S1674-2052(23)00005-9. doi:10.1016/j.molp.2023.01.005

Xiong J, Hu F, Ren J, Huang Y, Liu C, Wang K. Synthetic apomixis: the beginning of a new era. Curr Opin Biotechnol. 2023;79:102877. doi:10.1016/j.copbio.2022.102877

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