【业务升级】蛋白互作研究方法之GST pull-down/GST pull-down MS技术

2023年3月15日 0条评论 1,491次阅读 0人点赞
背景介绍
蛋白质是生命活动的直接执行者，通常是多个蛋白相互作用形成通路或者复杂的调控网络来调控多种生命过程。当一个基因被证明影响植物表型之后，如何深入研究影响该表型的内在调控机制呢？蛋白互作当然是少不了的啦！研究蛋白的相互作用是基因功能研究与调控机制解析的必选项，也是高分影响因子文章中最常见的研究思路。蛋白互作的研究方法有很多种，大家可根据不同实验目的及资源条件选择合适的研究方法，下图展示的方法我司均可提供，有需要的老师同学可联系我们的销售经理咨询哦！

《【业务升级】蛋白互作研究方法之GST pull-down/GST pull-down MS技术》

GST pull-down是验证蛋白互作的方法之一，常常被用来验证蛋白之间的直接相互作用，除了点对点验证已知的相互作用外，GST pull-down还可以与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析筛选互作蛋白，即GST pull-down MS，该方法步骤简单、操作方便。

原理简介
将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽填料上，充当一种“诱饵蛋白”，与靶蛋白能够相互作用的蛋白就会被拉下。如果已知互作蛋白，将该互作蛋白的溶液过柱，会被“诱饵蛋白”捕获，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用；如果互作蛋白未知，则将提取的总蛋白过柱，可捕获与“诱饵蛋白”相互作用的蛋白，洗脱结合物后通过色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析，从而筛选出互作蛋白。

1、GST pull-down
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注：对图中GST pull-down结果分析的解读：“-”表示反应体系中不添加对应的成分，“+”表示反应体系中添加对应的成分。Input为阳性对照，用于检测体系中有无对应的蛋白。在第一列反应体系中的B-His与GST正常加入并能检测到，在input中有对应条带，但B-His与GST不能相互作用，B-His不能与GST标签结合，所以在GSH球珠上洗脱下来的蛋白，用His抗体去检测没有条带（第4个方框，从上往下数）；在第二列反应体系中的B-His与GST-A都正常加入，在input中有对应条带，由于A与B互作，B-His与GST-A结合的复合物被GST标签拉下，洗脱分离后进行WB检测，与His抗体孵育，有B-His条带。

1.1 GST pull-down我司案例结果展示

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图1 Pull-down验证蛋白相互作用。

1.2 GST pull-down文献案例展示

“SPX4 Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through its Interaction with PHR2 in Rice”一文解析了SPX4通过与PHR2的相互作用负调控水稻的磷酸盐信号和稳态的分子机制，作者首先使用Co-IP联合液相质谱的方法坚定了PHR2相互作用的蛋白质SPX4。为了验证这个结论，作者利用3种方法证明了PHR2与SPX4之间的相互作用，其中之一使用的是pull-down的方法，具体的结果如下图所示。

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图2 SPX4与PHR2在体外相互作用的pull-down实验(Lv et al., 2014)。在大肠杆菌中表达并纯化PHR2-His、GST-SPX4和GST，并进行GST拉下实验。分别用GST和His抗体免疫印迹法检测GST/GST-SPX4和PHR2-His蛋白。

2、GST pull-down MS
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2.1 GST pull-down MS我司案例结果展示
表1 GST pull-down MS结果展示。
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注：我司还可以根据老师的需求对筛选得到的互作蛋白进行GO和KEGG功能富集分析。
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图3 GO功能分析结果（p-adjust＜0.05，选择最显著的前24 terms进行展示）。

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图4 KEGG功能分析结果。

2.2 GST pull-down MS文献案例展示
在“GST pull-down联合质谱分析筛选番茄SLSPRH1的互作蛋白”一文中，作者为进一步探究SLSPRH1（serine-proline-rich-homologous 1）在逆境应答中的作用机制，构建了原核表达载体，诱导表达GST-SLSPRH1融合蛋白，通过蛋白质体外结合GST pull-down试验筛选SLSPRH1的互作蛋白后进行质谱分析鉴定，并结合生物信息学分析，从蛋白质层面初步分析SLSPRH1的作用机制。SLSPRH1（Solyc06g053700）及15个SLSPRH1１结合蛋白的具体信息如下表。
表2 SLSPRH1特异性结合蛋白。
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图5 SLSPRH1互作蛋白GO功能富集分析(丁海东等，2021)。（A）SLSPRH1互作蛋白GO功能富集分析（生物过程、分子功能、细胞组成）；（B）生物过程的前15个GO功能富集分析，富集因子＝DEGs数／基因数，圆圈的大小表示基因数，圆圈颜色表示P值。

        小结

GST pull-down/GST pull-down MS的优点：

1、可验证蛋白质之间的直接相互作用；

2、步骤简单，操作方便；

3、GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。

References：

Lv Q, Zhong Y, Wang Y, et al. SPX4 Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through Its Interaction with PHR2 in Rice[J].The Plant Cell, 2014, 26:1586-1597.

丁海东, 钱 莹, 谢其慧, 等. GST pull-down联合质谱分析筛选番茄SLSPRH1的相互作用蛋白 [J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2021, 42(6): 36-41.

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