癌症是全世界的一个主要死因，2020年近1000万例（或近六分之一）死亡由癌症导致。免疫系统和肿瘤细胞之间存在复杂的相互作用，两者之间的平衡在决定癌症的产生方面起着至关重要的作用。肿瘤细胞通常可以被肿瘤抗原识别，随后被免疫系统消除。然而，由于它们快速的细胞分裂速率和突变压力，这种选择压力会导致产生能够逃避消除的肿瘤细胞。
肿瘤细胞逃避免疫细胞的机制包括以下三个：第一，免疫抑制肿瘤微环境（TME）的产生；第二，通过肿瘤抗原、主要组织相容性复合体（MHC）分子和/或共刺激分子的下调表达来逃避识别；第三，免疫细胞抑制的抑制分子的表达。这些抑制性配体与免疫检查点的相互作用调节免疫反应的时间和强度。免疫检查点抑制剂（ICI）会干扰这种负调节通路，并恢复抗肿瘤功能，并在包括非小细胞肺癌（NSCLC）和黑素瘤在内的众多癌症中取得了相当大的临床成功。尽管ICI取得了巨大的临床成功，但反应率最高仅达到40%，而且许多有反应的患者可能会产生耐药性。ICI治疗的一个主要障碍是治疗的价格，每个患者一个疗程花费约70000英镑。无限使用这些抗体的成本高得令人望而却步，尤其是在已经没有能力应对目前的疾病负担和癌症相关死亡率的中低收入国家。
与哺乳动物细胞平台相比，植物制造系统具有许多优势，包括较低的初始投资、较低的培养成本和易于扩展的生产。植物制成的产品也没有污染人类病原体、动物衍生产品和内毒素。此外，与哺乳动物细胞产生的蛋白质相比，植物产生的蛋白质具有更均匀的糖基化特征。这些因素对于吸引投资特别重要，尤其是来自中低收入国家的投资。
近日，伦敦大学感染与免疫研究所Audrey Y-H. Teh团队在Plant Biotechnology Journal上发表题为“Killer to cure: Expression and production costs calculation of tobacco plant-made cancer immune checkpoint inhibitors”的研究论文，研究探讨在工厂制造系统中生产ICI的可行性，旨在使用工厂制造系统向更广泛的市场提供价格合理的 ICI。
ICIs Monalizumab（抗-NKG2A）、Nivolumab（抗-PD-1）和 Relatimab（抗-LAG-3）使用植物表达系统MIDAS-P在本塞姆氏烟草和普通烟草中实现了成功瞬时表达。这些 ICI 最初以具有S228P突变的IgG4k形式表达（IgG4P）。这种形式与在哺乳动物细胞中进行的临床使用或临床试验中的形式一致。ICI 还以具有 L324A/L325A/P329G (LALAPG) 突变（IgG1AAG）的IgG1形式表达，以提高纯化回收率并减少Fcγ受体结合。
为了量化蛋白质积累水平，ICI被单独渗透或与含有番茄浓密矮化病毒（TBSV）P19转录后基因沉默抑制因子一起渗透。先前的研究表明该抑制因子可以增加ICI的积累水平。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）对从浸润叶中提取的ICI进行定量。当单独表达时，Nivolumab 的积累水平最高，为 0.073 g kg-1叶鲜重（LFW），其次是 Relatimab 和 Monalizumab（表1）。此外，Nivolumab 的 IgG4P 和 IgG1AAG 版本的蓄积水平之间没有显着差异（表 1）。与P19共表达有助于提高所有构建体的积累水平，与没有 P19 表达的表达水平相比，水平高约 5-10 倍（表1）。与P19共表达时，Nivolumab的积累水平增加到0.77 g kg-1。
表1. 免疫检查点抑制剂（ICI）的蛋白质积累水平。
然后，作者确认了具有IgG4P和 IgG1AAG形式的 Nivolumab 在可扩展提取和纯化环境中的性能。毫克和千克规模的提取和纯化过程之间的主要区别是：第一，提取方法不同（搅拌器与基于叶片的均质器）；第二，纯化方法不同（离心/过滤与袋/深度/无菌过滤）。有趣的是，与kg级规模下的 IgG4P相比，使用IgG1AAG恒定区确实增加了步进恢复。然而，总产品回收率下降了约10%，可能是在纯化阶段损失了更多的 IgG1AAG（表2）。
表2. 蛋白纯化不同阶段的蛋白质回收率。
流式细胞术分析显示，与IgG对照相比，IgG4P和IgG1AAG Nivolumab可以与活化的CD3+ T细胞结合（图 1A）。作者测试了 IgG4P 和 IgG1AAG Nivolumab的两个版本：一个带有 WT 植物糖基化；另一种具有在NtFX-KO植物系中产生的木糖基化和非岩藻糖基化糖基化。NtFX-KO是一种烟草品种：使用CRISPR/Cas9敲除α1,3-岩藻糖基转移酶和β1,2-木糖基转移酶基因的SR1植物系。植物制造的ICI的糖基化和Fc区不影响配体结合（图 1A）。在 CD4+和CD8+ T细胞中均观察到植物制造的Nivolumab和相关蛋白的结合（图 1B）。
图1：植物产生的ICI与对照相比的特异性
最后作者计算了植物生成ICI的成本。作者在上游植物生产和下游生物质加工方面增加了多种选择，从而优化了作者之前的成本模型。得出了两种生产方案：第一，在中高收入国家使用垂直农场进行全自动瞬时表达，用于生产急救或个性化药物；第二，在中低收入国家人工温室种植转基因植物。作者在图中添加了等成本线，表明 Pembrolizumab（绿色等成本线代表KEYTRUDA®）和 Nivolumab（橙色等成本线代表OPDIVO®）的5%销售价格（图 2A-D）。ICIs Pembrolizumab和Nivolumab 目前的销售价格为 26300 欧元每克（~31,600欧元每克；国家医疗保健与卓越研究所，2021 年）和28895欧元每克（~25500 欧元每克；Medicare & Medicaid Services, 2021) 。截至2021年8月，作者使用了通过瞬时表达在本塞姆氏烟草中实现的~0.46 g kg每克（IgG1AAG）和~0.23 g kg每克（IgG4P）的积累，结合0.35和0.50的各自回收率，建立工厂生产ICI。在该地区计算的生产成本为400欧元至2000欧元每克，比哺乳动物细胞生产的ICI在2021年的销售价格低约15-75倍。
图2：基于积累水平和回收率的工厂ICI生产成本。
总的来说，本研究探讨了在工厂制造系统中生产 ICI 的可行性。更具体地说，作者的目标是确定这些植物来源的ICI的蛋白质积累和恢复、配体结合特征、功能能力和制造成本。作者还展示了使用基于IgG1的恒定区来提高纯化回收率并减少Fcγ受体结合。这将大大促进在使用工厂制造系统向更广泛的市场提供价格合理的ICI。
