棉花作为我国的重要战略储备物资，因长期受黄萎病菌为害而造成棉纤维产量和品质的大幅下降。挖掘黄萎病抗性相关基因并解析其抗病分子机制对加快棉花抗黄萎病育种研究进程意义重大。WRKY转录因子与苯丙烷代谢路径在植物的防御响应过程中均扮演着重要角色，相关功能研究目前在多种植物中已有大量报道。然而，WRKY转录因子如何调节苯丙烷代谢通路并参与植物免疫反应的研究甚少。近日，华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室棉花研究团队朱龙付教授课题组联合新疆农科院阿里甫艾尔西研究员在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为《GhWRKY41 forms a positive feedback regulation loop and increases cotton defense response against Verticillium dahliae by regulating phenylpropanoid metabolism》的研究论文，解析了WRKY转录因子GhWRKY41与自身形成一个正反馈调节环，并通过调节苯丙烷代谢介导棉花对黄萎病菌产生抗性的分子机制。该研究首先分析了海岛棉‘7124’、陆地棉‘86-4’、‘中植棉2号’三个抗病棉花品种在接种黄萎病菌V991后的RNA-seq数据，在212个WRKY转录因子中挖掘到在三个品种中均强烈且快速诱导上调表达的WRKY基因GhWRKY41（图1）。该基因在棉花感病品种‘YZ1’中同样受黄萎病菌诱导上调表达，但上调表达倍数低于抗病品种。作者随后分别通过VIGS、拟南芥异源转化、棉花遗传转化实验证实了在棉花和拟南芥中超量表达GhWRKY41可显著提高对黄萎病菌的抗性，而敲低GhWRKY41则削弱棉花抗病性，表明GhWRKY41是一个棉花对黄萎病菌产生抗性的正调控因子（图2）。图1 WRKY基因在三个抗病棉花品种中受黄萎病菌诱导后的表达水平分析 图2 GhWRKY41在棉花和拟南芥中正调控对黄萎病菌的抗性为解析GhWRKY41介导棉花抗病性的分子机理，基于ChIP-seq和RNA-seq实验，作者鉴定到1019个GhWRKY41的靶标基因，其中有43.1%的靶基因可响应黄萎病菌的侵染，并呈上调表达趋势，推测GhWRKY41可能通过调控这些靶标介导棉花的免疫反应过程。有趣的是，通过ChIP-qPCR、Y1H和DLR实验分析，发现GhWRKY41可直接结合并驱动自身的表达。进一步地，通过筛选黄萎病菌接种棉花根部的酵母双杂交文库，作者鉴定到GhWRKY41可与自身发生互作而形成同源二聚体；GhWRKY41单体和同源二聚体在棉花细胞中可同时存在，且由黄萎病菌上清液或几丁质处理后可促进GhWRKY41单体向同源二聚体的转化，并放大对自身表达的驱动作用，证明了GhWRKY41可与自身形成一个正反馈调节环（图3）。图3 GhWRKY41与自身发生互作并激活GhWRKY41的表达在ChIP-seq数据中，作者鉴定到多个苯丙烷路径相关基因，推测GhWRKY41通过作用于苯丙烷代谢途径介导棉花的防御反应。因此，作者通过徒手切片和含量测定观察了木质素和多种黄酮物质在GhWRKY41转基因棉花材料中的积累水平。结果显示，超表达GhWRKY41后可促进木质素和黄酮的积累，而干涉GhWRKY41后则恰好相反，且这一趋势在接种黄萎病菌后更为显著（图4）。进一步通过ChIP-qPCR和DLR实验发现苯丙烷路径的两个限速酶基因GhC4H和Gh4CL直接受GhWRKY41的调控，且其表达水平可被GhWRKY41同源二聚体进一步放大。图4 GhWRKY41促进木质素和黄酮的积累综上所述，该研究鉴定到一个重要的棉花抗黄萎病相关基因GhWRKY41，在棉花受黄萎病菌侵染时，GhWRKY41迅速上调表达并与自身形成一个正反馈环放大棉花的防御反应，同时GhWRKY41二聚体通过直接激活苯丙烷途径关键基因GhC4H和Gh4CL表达促进木质素和多种黄酮物质的积累，进而提高棉花对黄萎病菌的抗性（图5）。这一研究不仅拓宽了我们对WRKY-WRKY蛋白互作和WRKY基因调控苯丙烷代谢路径的理解，也为棉花抗黄萎病遗传改良提供了一个新的候选基因。图5 GhWRKY41正反馈环参与苯丙烷代谢途径调控棉花黄萎病抗性的作用模型华中农业大学朱龙付教授和新疆农科院阿里甫艾尔西研究员为本文通讯作者，华中农业大学已毕业博士研究生肖胜华（现广西大学讲师）为论文第一作者。英国杜伦大学Keith Lindsey教授和美国农业部Steven J. Klosterman教授对本研究和论文撰写提供了指导和宝贵意见。本研究得到国家自然科学基金(32230076)和湖北洪山实验室项目(2021hszd006)的资助。文章来源：植物生物技术Pbj
