PNAS | 通过染色体修饰以增强CRISPR/Cas9的HDR（基因敲入）效率 2022年12月9日 0条评论 1,169次阅读 0人点赞 CRISPR/Cas9在生命科学领域可谓是大放异彩，两位重要的发现者埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna）也于2020年获得诺贝尔化学奖，以表彰她们在“凭借开发基因组编辑方法”方面作出的贡献。CRISPR/Cas9的工作原理也耳熟能详，简言之就是CRISPR酶在DNA中产生RNA引导的双链断裂（DSB），之后通过包括非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导的末端连接（MMEJ）和同源定向修复（HDR）等机制启动修复。NHEJ和MMEJ修复主要在剪切位点引入插入和缺失突变而破坏靶基因功能，而HDR在供体模板的存在下可以根据需求自定义突变类型，但相对于NHEJ和MMEJ修复，的HDR极低的效率限制了其广泛应用。虽然单碱基编辑和PE编辑也可实现精准的碱基替换和下片段的插入而无需DSB过程。然而，其仅局限于单碱基或者小于50bp且容易造成脱靶。因此，总得来说HDR仍然是实现精准的替换和插入的最通用方法。有研究表明，CRISPR/Cas9诱导的DSB后的NHEJ频率在常染色区域较高，而MMEJ和HDR偏向异染色质。 研究表明HDR和末端连接修复途径（即NHEJ和MMEJ）之间的平衡与位点特异性的染色质特征相关。H3K36三甲基化（H3K36me3）是一种对人类细胞同源重组（HR）至关重要的组蛋白修饰，先前的研究表明，在标记为H3K36me3的基因组位点，AsisI诱导的DSBs优先被HR修复。然而，位点特异性H3K36me3在CRISPR-Cas9诱导的DSBs的DNA修复中的作用仍未得到深入研究。 近日，CRISPR诺奖获奖者詹妮弗·杜德纳教授团队在国际著名杂志PNAS上在线发表了题为“Decorating chromatin for enhanced genome editing using CRISPR-Cas9”研究论文，将PRDM9（一种染色质重塑因子，其沉积组蛋白的H3K36me3和H3K4me3甲基化修饰以介导人类细胞中的同源重组）与Cas9融合，使得HDR效率提高了三倍，HDR:indel比率提高了五倍，且没有增加脱靶效应，证明了H3K36me3的存在有利于CRISPR-Cas9切割后通过HDR来进行DSB的修复。 为了评估内源性染色质结构是否影响Cas9活性和DNA修复途径选择，作者利用ENCODE数据库中公开的人类胚胎肾293（HEK293）细胞的ChIP-seq数据，检查了H3K36me3和H3K4me3修饰谱，并选择了具有不同H3K36me3和H3K4me3富集度的16个靶点，随后用Cas9和sgRNA表达质粒以及单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板转染HEK293T细胞来测量每个位点的HDR频率。结果表明被广泛的标记为H3K36me3修饰的位点A1表现出较高（8.3±0.6%）的HDR率，而缺少组蛋白修饰的位点C1具有最低的HDR率（1.3±0.1%）（图1）。类似地，仅富含H3K36me3修饰的位点具有较高比率的HDR:indel。而仅富含H3K4me3的位点（位点D1、D2、D4和D5）平均显示出最低的HDR效率和HDR:indel比率，表明H3K4me3也可能阻碍Cas9诱导的DSB后的HDR过程。总之，作者的研究结果表明，Cas9诱导的DSBs后，内源性H3K36ma3有利于HDR。 图1. 内源性组蛋白修饰介导的DNA修复途径的选择。 基于上述发现和先前的研究，作者猜想诱导组蛋白修饰可能影响Cas9诱导的DNA切割后的修复途径的选择。因此，为了验证这一想法，作者融合了四种类型的嵌合体蛋白到Cas9的N端（图2B），其中1）PRDM9-Cas9包括用于招募其他蛋白来促进重组的KRAB domain、催化甲基转移酶活性的PR/SET domain和post-SET single zinc finger (ZnF)。2）PRDM9dC-Cas9缺乏post-SET ZnF；3）SETD2-Cas9包含SETD2（是目前已知H3K36me3形成的唯一三甲基化酶。目前已知SETD2/H3K36me3主要功能包括参与DNA损伤修复，维持染色质活跃状态、协助转录延伸从而促进基因转录水平）的SET和post-SET domains；4）SETMAR-Cas9包含SETMAR（促进NHEJ修复）的SET domain。结果表明PRDM9-dCas9有最高的的效率和特异性，且表现出更高的HDR活性和HDR:Indel比。更为关键的是PRDM9-Cas9在多个不同哺乳动物细胞系的多个内源性位点中显示出高的HDR和低的indels修复。 图2. 设计的cas9-甲基转移酶融合蛋白用以调节DNA修复途径的选择 图3. PRDM9-Cas9融合蛋白在多个基因组位点上显示出更高的HDR效率和HDR:indel比。 目前，这一高效的PRDM9(KRAB-SSXRD-PR/SET-ZF1-dC)-Cas9载体已经在addgene（https://www.addgene.org/184464/）公开，相关载体序列信息均可下载。 文章来源：植物生物技术Pbj < 上一篇 下一篇 > 发表回复 取消回复您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注 * *
