原来转基因材料还可以继续这样研究！

2022年11月24日 0条评论 373次阅读 0人点赞

在研究植物发育、营养吸收、抗病抗逆等相关基因的功能时，一般都会用到转基因技术来进行验证。例如，通过对目的基因进行过表达，来增加目的蛋白的含量，进而增强或减弱其在生理生化过程中的作用，并通过比较过表达材料与野生型材料在表型、生理生化上的一系列差异来研究该基因的功能。同时，过表达材料也可以和基因敲除、敲低的突变体材料相互比较、互相印证，从而进一步确定基因的功能，再接着，大家可以做些蛋白实验，继续拓展基因调控网络，更多内容可参考文章“常规基因功能研究套路总结”。在整个研究过程中，大家会获得许多的转基因材料，它们除了能够完成上述的实验外，换一个研究角度，就可以继续在植物——微生物互作研究中发光发热。本期伯小远就带领大家一起看看，如何用我们手头的转基因材料，开启植物功能基因与根际微生物的互作研究~

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图1 植物根际微生物(Philippot et al., 2013)。

1.前言
我们首先一起来回顾一下植物根际微生物的相关知识，植物根际微生物是指生活在植物根系与土壤之间的微生物，它们与植物之间的相互作用深刻的影响着植物生长以及植物对生物、非生物胁迫的耐受性。植物功能基因对根际微生物组的影响是基于分子信号的传递来进行的。例如，植物可以通过调控有机酸通道蛋白基因的表达来促进有机酸的产生，从而通过增加根际土壤的pH值来招募有益的微生物。尽管基因只能解释根际微生物组总变异的一部分，但越来越多的研究者认为功能基因是调控微生物组的一个重要因素。

1.1 养分吸收相关的基因对根际微生物的调控

植物在生长发育过程中可以通过调节养分吸收相关的基因来招募土壤中的微生物，从而增强自身对环境的应对能力。其作用机制之一是通过增加根的表面积、根毛和侧根进而改变根际微生物的群落组成，例如，玉米可以通过调控Rum1基因的表达来改变侧根的形成并影响根际微生物的组成。与野生型相比，玉米突变体rum1由于侧根的缺乏，其根系发育区的根际细菌多样性明显减少(Yu et al., 2021)。养分吸收和运输相关的基因还可以通过调节根细胞转运蛋白的活性、有机酸以及激素等根系分泌物的产生，从而调节植物养分的利用，并改变根部微生物的组成。例如，ABC转运体abcg30（Atpdr2）受损的拟南芥突变体在增加酚类物质分泌的同时会减少根部糖类物质的分泌，从而形成一个特定的根际微生物群落(Badri et al., 2009; Cordovez et al., 2019)。

1.2 抗病基因对根际微生物的调控

为了更好的生存，植物在长期的进化过程中逐渐产生了抵御病原体等多种响应生物胁迫的机制，其中，抗病基因介导的根际微生物群落的重塑有助于增强植物自身对一些特定生物胁迫的耐受性。例如，葫芦科植物可以通过细胞质膜上的转运蛋白MATE将细胞质中合成的葫芦素转运至细胞外，最后分泌到土壤中来改变根际微生物群落组成，进而提高植物对枯萎病的抗性(Zhong et al., 2022)。

长期以来，人们发现假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）会在多种抑病土壤系统中富集，并且通过多种机制抑制土壤病害。微生物的高通量测序也证实了病原体感染后植物根际假单胞菌属会广泛富集。近期的研究表明，具有多种功能的受体激酶FERONIA（FER），通过调节鸟苷三磷酸酶ROP2（GTPase）维持根系内的基础活性氧（ROS）水平，进而负调控假单胞菌在根际的定殖(Song et al., 2021)。值得注意的是，ROP途径也参与调控大豆与根瘤菌共生，这表明该途径在植物进化及与共生微生物相互作用中起着关键作用。

1.3 抗非生物胁迫基因对根际微生物的调控

除了生物胁迫之外，植物还会受到重金属等非生物胁迫的影响。与前述养分相关基因类似，非生物胁迫抗性基因可以通过改变土壤中的离子含量以及代谢产物从而调控根际微生物来应对胁迫。研究表明，在高铝（Al）胁迫下，大豆可以通过提高GmMATE58和GmMATE1的表达量，来促进苹果酸、草酸和酚类化合物等物质的分泌，从而招募土壤中特定的微生物来增强大豆抵抗Al毒害的能力(Chen and Liao, 2016; Li et al., 2018; Liu et al., 2016; Zhou et al., 2018)。在盐胁迫条件下，植物细胞中会积累过量的盐离子从而对多种生理代谢产生不利的影响。而水稻SST基因的突变不仅可以减少钠离子的积累，缓解盐分胁迫，还可以改变根际环境，进而影响根际微生物的群落组成。相比于对照组，缺失SST基因的植物根际土壤中的蛋白杆菌和放线菌的相对丰度显著高于对照(Lian et al., 2020)。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图2 植物功能基因调控根际微生物多样性和功能(Liu et al., 2022)。

2.文献举例
了解完功能基因对微生物的调控之后，接下来，我们以发表在微生物杂志mSystems上的文章“Rice SST Variation Shapes the Rhizosphere Bacterial Community, Conferring Tolerance to Salt Stress through Regulating Soil Metabolites”为例，来学习一下如何开展具体的研究。

2.1 研究背景

SPL（Squamosa promoter binding Protein-Like）家族是一类植物特异性转录因子，具有高度保守的DNA结合结构域SBP盒。它们在植物生长发育中起着重要的作用，包括侧根发育、地上部和叶片形态发生、花器官发育、开花和果实成熟等。近年来，越来越多的证据表明，SPLs是植物耐受非生物胁迫的重要调节因子。作者在先前的研究中表明，水稻幼苗耐盐基因SST（OsSPL10）功能的丧失可以导致植物对盐胁迫有更好的适应能力。此外，根际有益微生物能够通过降低乙烯水平、刺激根增殖以及增加植物对缺水的适应，从而来克服盐诱导的生长抑制。并且，许多研究已经证明植物可以通过根系分泌物来招募有益微生物抵抗外界胁迫。然而，水稻SST基因是否可以通过调节根际代谢产物和微生物区系来缓解外界盐胁迫，目前尚不清楚。

2.2 研究结果及思路总结

本研究以籼稻品种黄花占（HHZ）、R401（WT），粳稻品种中花11，通过辐射诱变获得的R401耐盐突变体（sst），以及HHZ和ZH11的SST基因编辑突变体（HHZcas和ZH11cas）为材料，通过16S rRNA高通量测序，检测不同材料根际菌群的差异，并结合代谢产物测定，进一步确定SST基因变异对土壤代谢物的影响，以及根际微生物与土壤代谢物的关系。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

2.2.1 SST功能的丧失能够缓解水稻盐胁迫

首先为了明确SST突变对植株耐盐性的影响，作者通过设置盐处理组（在土壤中加入150mM的氯化钠），来对比不同材料在正常生长和盐胁迫条件下的生长差异，结果显示，在正常土壤条件下，所有材料的生长无明显差异，而盐胁迫条件下只有sst、HHZcas和ZH11cas能够正常生长，且三种材料的表型差异不明显，这三种材料的耐盐性表型也与先前的研究结论一致。另外，作者还测定了不同材料的Na+含量，结果显示，不含SST基因的植株（HHZcas、ZH11cas和sst）的钠离子含量显著下降，这表明SST基因的突变可能是通过减少水稻幼苗对盐离子的吸收来提高植株的耐盐性的。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图3 WT、sst、HHZ、HHZcas、ZH11和ZH11cas水稻植株在对照处理（A-C）或150mM盐处理（D-F）后的表型差氯化钠。（G）不同处理条件下水稻植株的K+浓度。（H）不同处理条件下水稻植株的Na+浓度(Lian et al., 2020)。

2.2.2 SST基因对根际微生物群落的影响

为了探究SST基因对根际微生物群落的影响，作者首先采集了图3中不同基因型水稻在正常生长和盐胁迫条件下的根际土壤样品，通过16S rRNA高通量测序分析得知，在盐胁迫条件下，ZH11cas和sst根际细菌的多样性显著低于ZH11和WT（图4B），并且HHZ、ZH11和WT植株根际微生物的群落组成与HHZcas、ZH11cas和sst植株相比有很大差异（图4B和表1），这些结果表明SST基因会影响盐胁迫条件下水稻根际细菌群落的多样性和组成。典型对应分析（CCA）显示土壤菌群结构与土壤中NH4+-N、Na+和Cl–的浓度相关（图4C），且2.2.1的结果表明SST基因可以影响植物对Na+离子的吸收，因此SST基因可能是通过影响根际土壤中的离子含量进而对细菌的组成产生影响。此外，对根际细菌门水平的相对丰度分析表明，缺失SST基因的植物根际土壤中的蛋白杆菌和放线菌的相对丰度显著高于对照，而氯杆菌、微藻、酸杆菌和硝螺旋菌的相对丰度则表现出相反的变化趋势（图4D）。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图4 （A）盐处理和SST基因对水稻根际细菌Shannon多样性指数的影响；（B）基于Bray-Curtis相似性的主坐标分析（PCoA）；（C）典型对应分析（CCA）；（D）细菌门水平的相对丰度分析(Lian et al., 2020)。

表1 用PERMANOVA评估水稻基因型对细菌群落结构的影响(Lian et al., 2020)。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

对盐胁迫条件下的根际细菌种类进一步分析发现，OTU1，OTU17，OTU19，OTU9，OTU81，OTU42，OTU30和OTU95在ZH11cas、HHZcas和sst基因型的根际的丰度分别比ZH11、HHZ和WT基因型的高（图5）。在先前的报道中了解到与OTU19同一类的一些红杆菌能够产生IAA，这类微生物或许能够提高水稻对盐胁迫的抗性。

[注：在细菌16S多样性研究中，目前主要按照序列97%的相似性进行OTU聚类，一个OUT代表属于同一类的微生物]

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图5 （A）OTUs的Venn分析；（B-D）OUT的相对丰度分析(Lian et al., 2020)。

2.2.3 盐胁迫条件下的土壤代谢物分析

为了探究SST基因调控水稻根际微生物的潜在机制，本研究利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析了盐胁迫条件下HHZ和转基因（T2）植株（HHZcas）的根际土壤代谢产物。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）表明，盐胁迫条件下，HHZ和HHZcas植株根际土壤代谢物之间有明显的分离（图6）。通过组合和筛选过程，作者获得了在不同水稻材料之间差异表达的土壤代谢物。结合KEGG途径富集分析发现，与HHZ植物相比，HHZcas植物中水杨素、熊果苷6-磷酸、CAIR、磷酸甘油酸、5-O-3-磷酸莽草酸和1-亚甲基-N-乙酰半乳糖胺的表达上调（图7）。这些被显著上调的代谢物可以作为微生物群落的碳源和能源，因此可能对微生物的生长存在一定的影响。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图6 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果(Lian et al., 2020)。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图7 关键差异表达代谢物所涉及的代谢途径(Lian et al., 2020)。

2.2.4 根际微生物与土壤代谢物的相关性分析

在确定了SST基因对根际微生物以及根际土壤代谢物的影响后，为了进一步探究根际微生物与土壤代谢物之间的相关性。作者通过Pearson相关分析，发现根际土壤微生物与代谢物之间的相关性，在Na-HHZ和Na-HHZcas之间差异显著。其中，OTU1157（类杆菌）、OTU231（梭状芽孢杆菌）和OTU292（厌氧菌）这三类细菌与景天庚酮糖、7-磷酸、乙醛酸、溴苯呈正相关，与熊果苷、6-磷酸、水杨素呈负相关。而OTU1（Dyella）和OTU81（根瘤菌）与上述代谢物的关系则呈现出完全相反的趋势。此外，作者还发现OTU1、OTU19（未分类-红杆菌科）和OTU81的相对丰度与L-硒代半胱氨酸呈负相关，而OTU19与当归素和磷酸异戊烯酯也呈显著负相关（图8）。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图8 盐胁迫条件下HHZ和HHZcas植物根际微生物与土壤代谢物的相关性分析(Lian et al., 2020)。

2.2.5 研究结论

至此上述研究的全部结果都已顺利获得，结合所有的数据我们可以发现SST基因的突变不仅可以通过减少植物体内Na+离子的积累来缓解水稻的盐胁迫，还可以通过改变根际土壤中的代谢产物，来影响根际微生物的群落组成，进而使微生物协助宿主抵抗盐胁迫（图9）。

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

图9 SST基因调控水稻根际微生物的模式图(Lian et al., 2020)。

2.3 小结

通过阅读这篇有关根际微生物的文章，大家会发现作者是在明确SST基因的功能后，利用手头现有的转基因材料来深入研究另一个科学问题“SST功能基因对根际微生物的调控”，并且作者还结合其它的研究进展提出了“SST是否对根际土壤代谢物存在影响”以及“根际土壤代谢物与微生物之间又存在何种关联”两个问题。确定好自己要研究的科学问题后，作者先设计了实验思路，然后利用现有的植物材料结合微生物测序分析以及代谢物测定来共同解析所提出的科学问题。在这篇文章中想必大家也注意到了文中有特别多的数据分析结果，因此大家如果想参考这篇文章的研究思路来研究自己的转基因材料的话，那么数据分析这一块一定要花一些时间来学习，打好生物信息学分析的基础哦！

另外，在常规基因功能研究过程中，如果额外添加一些微生物数据分析也会给自己的文章添加不少亮点，具体的研究思路可以参考发表在Nature Plants上题为“Root-secreted bitter triterpene modulates the rhizosphere microbiota to improve plant fitness”的文章，除此之外，还有很多其它的文章，大家如果感兴趣的话可以通过检索关键词如“rhizosphere microbiota”来查看相关的文献，另外，大家也可以通过查看一些植物微生物领域的大课题组的研究成果来学习相关的研究思路。总之，小远想说大家手中的转基因材料研究完之后可以试着换一条思路，或许研究根际微生物也是不错的选择哦。

小远叨叨
 文章至此就告一段落了，本文主要是和大家聊了聊植物功能基因对根际微生物的调控作用，想必有的小伙伴一定会疑问那微生物是否会对植物功能基因产生影响呢？答案是肯定的，关于这一部分的内容，因为篇幅有限，小远今天没有给大家展开讨论，大家如果感兴趣的话可以留言，小远会尽快安排上！另外，在本文的文献举例中，小远只写了一个最常规的例子，大家不要被研究思路局限住，也可以以这个研究思路为基础结合自己研究领域的特色以及其它微生物文章中的研究思路大胆做出创新哦。

References：

Badri DV, Quintana N, El Kassis EG, et al. An ABC transporter mutation alters root exudation of phytochemicals that provoke an overhaul of natural soil microbiota. Plant Physiol. 2009, 151(4): 2006-17.

Chen ZC, Liao H. Organic acid anions: An effective defensive weapon for plants against aluminum toxicity and phosphorus deficiency in acidic soils. J Genet Genomics. 2016, 43(11): 631-638.

Cordovez V, Dini-Andreote F, Carrió n VJ, et al. Ecology and Evolution of Plant Microbiomes. Annu Rev Microbiol. 2019, 73: 69-88.

Liu J, Li Y, Wang W, et al. Genome-wide analysis of MATE transporters and expression patterns of a subgroup of MATE genes in response to aluminum toxicity in soybean. BMC Genomics. 2016, 17:223.

Li GZ, Wang ZQ, Yokosho K, et al. Transcription factor WRKY22 promotes aluminum tolerance via activation of OsFRDL4 expression and enhancement of citrate secretion in rice (Oryza sativa). New Phytol. 2018, 219(1): 149-162.

Lian T, Huang Y, Xie X, et al. Rice SST Variation Shapes the Rhizosphere Bacterial Community, Conferring Tolerance to Salt Stress through Regulating Soil Metabolites. mSystems. 2020, 5(6): e00721-20.

Liu Q, Cheng L, Nian H, et al. Linking plant functional genes to rhizosphere microbes: a review. Plant Biotechnol J. 2022.

Philippot L, Raaijmakers JM, Lemanceau P, et al. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nat Rev Microbiol. 2013, 11(11): 789-99.

Song Y, Wilson AJ, Zhang XC, et al. FERONIA restricts Pseudomonas in the rhizosphere microbiome via regulation of reactive oxygen species. Nat Plants. 2021, 7(5): 644-654.

Yu P, He X, Baer M, et al. Plant flavones enrich rhizosphere Oxalobacteraceae to improve maize performance under nitrogen deprivation. Nat Plants. 2021, 7(4): 481-499.

Zhou Y, Yang Z, Xu Y, et al. Soybean NADP-Malic Enzyme Functions in Malate and Citrate Metabolism and Contributes to Their Efflux under Al Stress. Front Plant Sci. 2018, 8: 2246.

Zhong Y, Xun W, Wang X, et al. Root-secreted bitter triterpene modulates the rhizosphere microbiota to improve plant fitness. Nat Plants. 2022, 8(8): 887-896.

《原来转基因材料还可以继续这样研究！》

点赞

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注