【烟草知识】本氏烟——烟草中的“清流”，科学界的“宠儿”

2022年9月14日 0条评论 22,775次阅读 4人点赞

《【烟草知识】本氏烟——烟草中的“清流”，科学界的“宠儿”》

烟草的历史

1.1 “出道即巅峰”

烟草（Nicotiana tabacum）原产于南美洲。早在3500年前，人们就开始种植烟草。据文献记载，美洲土著民将烟草奉为“万灵圣药”，用烟草治疗各种疾病，如感冒、头痛、牙痛、创伤、烧伤、脓疮溃烂，还可麻醉、牙齿美白、抗疲劳等，甚至能治愈绝症。1501年，随着大航海家哥伦布的船员将烟草和抽烟的习惯从美洲带回了西班牙，烟草便在整个欧洲传播开来。1560年前后，法国驻葡萄牙大使杰恩·尼古特（Jean Nicot）用烟草治好许多病人的创伤和顽疾，并将烟草赠送给了当时的法兰西皇室，鉴于尼古特的慷慨大方，烟草在当时被称为“大使草”。后来人们为了纪念尼古特在烟草传播中的突出贡献，就把烟草中特有的植物碱——烟碱命名为尼古丁（nicotine）。

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图1 南美洲土著教哥伦布的两个船员在吸食烟草（来源于：https://gimg2.baidu.com/）。

1.2 “天使与恶魔”

由于其医疗药用价值，烟草很快遍布世界各地，但尼古丁也使人们对烟草上了瘾。到了现代，用烟草制作的香烟成了社交的硬通货，是我国的主要税源之一。但烟草的危害成为了当今世界严重的公共卫生问题之一。众多的科学证据表明，吸烟和二手烟（被动吸烟）严重危害人类健康。烟草燃烧后产生的气体混合物称为烟草烟雾，烟草烟雾中含有7000余种化学成分，其中数百种为有害物质，会对人体健康造成严重危害，其中还含有至少69种已知的致癌物，但由于尼古丁的原因，人们很难戒段吸烟。世界卫生组织（WHO）的统计数字显示，全世界每年因吸烟死亡的人数高达600万，即平均每6秒钟就有1人死于吸烟相关疾病。

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图2 吸烟有害健康（来源于：https://www.sohu.com/a/397667211_100237836）。

02
脱颖而出的本氏烟

本氏烟（Nicotiana benthamiana）与制作香烟的烟草品种不同，是烟草中的一股清流，其凭借对病毒的易感性和在瞬时表达转基因的广泛运用成为植物生物学的“宠儿”。本氏烟是如何从烟草中脱颖而出的呢？一切还要从头说起。

本氏烟属于茄科（Solanaceae）烟草属植物，是异源四倍体，它的基因组由19条染色体组成。本氏烟的祖先可能是美烟草（Nicotiana sylvestris），大约在20Mya（millions of years ago），美烟草从南美洲跨越大平洋来到了澳大利亚，由于当时澳大利亚气候普遍温暖潮湿，适宜生长，开始遍布澳大利亚并独立进化。但随后，恶劣气候的多次反复导致澳大利亚中部出现了大片沙漠地带，为了适应不同地区环境，从祖先美烟草分化出不同的株系，被称为烟草亚属Suaveolentes（图3a）(Bally et al., 2015)。

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图3 a）烟草属的系统发育树(Bally et al. 2018)；b）不同本氏烟株系的Rdr1基因序列比对，LAB和16C为实验室使用的本氏烟株系，其他均为野生株系(Bally et al., 2015)。

为了适应极端干旱的天气，本氏烟株系的RNA聚合酶基因Rdr1发生了72nt插入的自然突变（图3b）。Waterhouse团队通过检测本氏烟株系对病毒感染的反应及其与Rdr1基因型的相关性，确定了本氏烟实验室株系（LAB和16C）和一种野生型株系（SA）的病毒易感性就源于Rdr1的功能障碍（图4）。同时还发现Rdr1突变植株的发芽率、种子活力和幼苗生长也显著增加，这些结果证明了LAB和SA中RDR1功能的丧失增强了本氏烟在干旱地区的早期存活能力，也正是由于极端环境中生命周期短以及病原体少，使得本氏烟自我授粉，维持突变体长期稳定纯合(Bally et al., 2015)。

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图4 本氏烟草株系对病毒感染的反应及其与其Rdr1基因型的相关性(Bally et al., 2015)。a）本氏烟草株系的染病症状严重程度；b）用TMV-GFP接种后20天的小植株；c）PVX-GFP对不同株系叶子的侵染情况；d）N.benthamiana LAB与QLD杂交的株系被TMV-U1侵染40天后的情况，（1）Rdr1纯合突变体，（2）杂合突变体，（3）功能正常的Rdr1纯合子；e）Rdr1基因PCR分析；f）用microRNA靶向Rdr1的转基因WA株系的Rdr1转录水平；g）被TMV-U侵染11天后，转基因WA株系的情况。

在1940年左右本氏烟被病毒学家发现，并在1980年左右广泛用于病毒存在和鉴定的诊断分析，而本氏烟的“明星”之路才刚刚开始。

03
本氏烟的“十八般武艺”

本氏烟因为对大部分病毒敏感而走入科学家的视野，但除此之外，本氏烟还有许多用于科学研究的优势，它不仅对病毒敏感，还对许多其他病原微生物敏感，所以被广泛应用于植物与植物-病原微生物互作研究；本氏烟植株较小但叶片大且茂盛，培养周期短，在实验室条件下易于种植，利于大量收集实验材料；本氏烟作为模式植物，可以在植物体内完成基因表达调控及蛋白翻译后修饰，比E.coil、酵母更适合进行异源基因的功能验证；随着视觉报告基因（荧光蛋白基因等）的开发和农杆菌介导基因瞬时转化体系的大力发展，让在本氏烟中瞬时，快速，大量表达外源蛋白进行功能研究变得更加便利，因此，本氏烟目前也被广泛的应用于蛋白亚细胞定位、蛋白互作、生物医药生产等方面。

3.1 病毒介导的基因沉默技术（VIGS）

通过病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技术可下调植物内源基因表达，在多种双单子叶植物中均有广泛应用。而本氏烟中VIGS也是应用最为广泛，基因沉默效果最好的，因此，常被作为无转化体系物种的研究工具。

北京林业大学田呈明课题组为了探究杨树腐烂病菌（Cytospora chrysosperma）丝裂原活化蛋白激酶CcPmk1的功能，利用VIGS在本氏烟中瞬时表达TRV-CcPmk1和TRV-BcPmk1（灰霉菌中Pmk1的同源基因）载体，并接种灰霉菌。灰霉菌的侵染在表达TRV-CcPmk1和TRV-BcPmk1载体的烟草叶片上受到了显著的抑制（图5），表明CcPmk1在致病侵染过程中发挥了重要的调控功能(Xiong et al., 2021)。

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图5 灰霉菌Botrytis cinerea中病毒诱导的BcPmk1基因沉默(Xiong et al., 2021)。a）TRV2-GFP、TRV2-CcPmk1和TRV2-BcPmk1表达载体的构建；b）沉默本氏烟中的NbPDS基因导致叶片呈漂白色；c）用农杆菌携带的TRV1和TRV2构建体接种本氏烟后的致病性测定；d）不同接种的本氏烟草叶子的感染区域；e）BcPmk1的相对表达水平。

3.2 亚细胞定位

蛋白在植物体内的细胞定位对于研究蛋白的功能尤为重要，但构建荧光蛋白稳定表达拟南芥或其他植物品系可能需要数月至数年之久，而利用农杆菌在烟草中瞬时表达可以大大缩短研究蛋白细胞定位的周期。随着不断开发的各种荧光蛋白及不同荧光染料，如：GFP、RFP、YFP以及DAPI、FM-64等，将实时监控蛋白质亚细胞定位的时空动态成为现实。基于不同荧光蛋白的不同亚细胞定位marker蛋白也被广泛应用于本氏烟表达系统中，通过共定位进一步确定目的蛋白亚细胞定位情况。

宁波大学陈剑平和孙宗涛团队围绕P1蛋白在SMV分离物SMVNB和SMVGZL中的功能差异展开了相关研究，在研究中为了确定不同P1蛋白的亚细胞定位，构建了载体在本氏烟中进行瞬时表达。在细胞质和细胞核中观察到用作对照的GFP（图6c），而在类似于叶绿体的结构中观察到融合蛋白，但P1NB-GFP的GFP信号（图6a）比P1GZL-GFP弱（图6b）。进一步的共定位表明，P1GZL-GFP和P1NB-GFP的GFP信号与叶绿体的自发荧光融合，证实它们确实定位于叶绿体中(Mao et al., 2022)。

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图6 P1NB-GFP和P1GZL-GFP在本氏烟中的亚细胞定位(Mao et al., 2022)。

3.3 蛋白质互作

本氏烟在植物学研究中最为关键的应用就是利用农杆菌介导瞬时表达系统研究蛋白质-蛋白质相互作用，如基于免疫沉淀的Co-IP、IP-MS/MS技术、基于双分子互补技术的BiFC等。此外，通过添加激素，小肽，蛋白质合成与降解抑制化合物等小分子化合物可以进一步检测蛋白质实时互作动态，大大加速对蛋白互作网络，生物化学功能研究。

中国科学院遗传与发育生物学研究所赵燕借助本氏烟瞬时表达系统，将含有融合蛋白的植物表达载体转化农杆菌后注射烟草叶片。24–48小时后，加入反应底物萤火素，利用植物活体分子影像系统（CCD imaging system）或luminometer来定性定量检测荧光强度，以判定目标蛋白之间是否存在相互作用及互作的程度(赵燕和周俭明，2020)。

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图7  A）利用植物活体成像系统采集烟草叶片的发光图像（Bar=2cm）；B）使用luminometer检测萤火素酶活性；C）Western blot检测CLuc和NLuc融合蛋白的表达，融合蛋白分别用anti-luciferase和anti-CLuc抗体来检测(赵燕和周俭明, 2020)。

3.4 不同植物物种的嫁接“媒婆”

日本名古屋大学Michitaka Notaguchi研究团队发现，本氏烟嫁接能力突出，与不同科的植物也能成功嫁接，“秘诀”在于烟草激活了与创伤修复、重建细胞壁相关的基因NbGH9B3，而这一基因能够编码促进细胞与细胞黏附的β-1,4-葡聚糖酶。由于烟草的这一特性，研究人员将本氏烟用作嫁接中介，将番茄接穗嫁接到拟南芥或者菊花砧木上，发现番茄接穗成功结实（图8）。进而，研究团队还成功完成了以本氏烟为嫁接中介的其他跨物种嫁接实验(Notaguchi et al., 2020)。

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图8 使用烟草作嫁接中介，将番茄接穗嫁接到拟南芥（E为嫁接后21天，F为嫁接后4个月）或者菊花砧木（G为嫁接后3个月）上(Notaguchi et al., 2020)。

3.5 生物医药生产

除了进行植物学研究外，本氏烟还被广泛应用于生物医药行业，例如制造抗体等药物，目前已用于流感病毒，埃博拉病毒，登革热病毒，甲乙丙肝病毒，西尼罗河病毒等多种病毒的抗体制备研究。

2021年罗马尼亚生物化学研究所利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟中表达全长丙肝病毒（HCV）的E2糖蛋白。该研究表明本氏烟是昂贵哺乳动物细胞培养物的可行替代品，并支持将植物用作开发HCV疫苗的经济有效的生产平台(Dobrica et al., 2021)。

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图9 对本氏烟草和哺乳动物细胞中产生的HCV-E2的N-聚糖化分析，证明了植物中表达的抗原具有HCV活性并能诱导宿主产生抗体(Dobrica et al., 2021)。

小远叨叨
熬过澳大利亚的极端气候，本氏烟获得了更强的生存耐受力，也在千万年后遇到了将其视为“宠儿”的科学家，它得以大展拳脚。人也一样，需要经历一段付出了很多努力的漫长时光，将未来的路照亮。本氏烟可能还有许多隐藏价值未被发现，这篇介绍也许并没有将本氏烟的所有应用都列举出来，还需要大家去努力探寻。

References：

Bally J, et al. 2018. The Rise and Rise of Nicotiana benthamiana: A Plant for All Reasons. Annu Rev Phytopathol 56:405-426.

Bally J, et al. 2015. The extremophile Nicotiana benthamiana has traded viral defence for early vigour. Nat Plants 1:15165.

Dobrica MO, et al. 2021. Hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein produced in Nicotiana benthamiana triggers humoral response with virus-neutralizing activity in vaccinated mice. Plant Biotechnol J 19:2027-2039.

Mao C, et al. 2022. The hypervariable N-terminal of soybean mosaic virus P1 protein influences its pathogenicity and host defense responses. Phytopathology Research 4.

Notaguchi M, et al. 2020. Cell-cell adhesion in plant grafting is facilitated by b-1,4-glucanases. Science 369, 698–702 (2020)

Xiong D, et al. 2021. CcPmk1 is a regulator of pathogenicity in Cytospora chrysosperma and can be used as a potential target for disease control. Mol Plant Pathol 22:710-726.

赵燕, 周俭民. 2020. 萤火素酶互补实验检测蛋白互作. 植物学报 55(01):69-75.

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官网链接：plant.biorun.com
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