你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？

2022年8月25日 0条评论 1,739次阅读 0人点赞
蛋白互作在细胞生命活动中发挥着关键作用，并且在不同的时空层面上参与多种细胞学过程，例如，调控细胞周期、蛋白质的合成与分泌、信号转导与代谢等。因此研究蛋白互作对于理解分子调控网络至关重要。目前大家常用的寻找蛋白互作研究手段主要有酵母双杂交（Y2H）筛选和免疫共沉淀结合质谱（IP-MS）分析。使用Y2H研究互作蛋白时需要构建合适的cDNA文库，这一步往往费时费力，并且酵母细胞作为单细胞真核生物与高等真核多细胞生物如植物细胞之间存在显著差别。在大多数情况下，免疫共沉淀（Co-IP）因为不能有效地捕获瞬时或较弱的蛋白相互作用而存在一定的限制。基于以上原因，科学家们开发出了一种新的研究相互作用的蛋白质组学技术——邻近标记技术（Proximity labeling, PL），它不仅无需构建文库或使用抗体，还对疏水性和低丰度蛋白的互作蛋白鉴定以及弱/瞬时互作蛋白的分析具有独特的优势(Yang et al., 2021)。该技术在2017年被首次应用在水稻原生质体中后，陆续在本氏烟、拟南芥、番茄中也有相关报道，今天伯小远就带领大家一起来详细学习一下什么是邻近标记技术吧~
原理简介
邻近标记可直接在自然条件下的活细胞内进行，有利于捕获体内瞬时发生或微弱的蛋白互作关系，帮助科研人员更好地理解细胞内复杂的生物学过程。其原理是将一个具有特定催化连接活性的工具酶与目的蛋白融合，通过添加小分子底物（如生物素（biotin）），在工具酶的催化作用下小分子底物被活化并共价连接到酶邻近的内源蛋白上，被标记的蛋白经富集后进行质谱分析，可鉴定目的蛋白的互作或邻近的蛋白信息(苏田等, 2020)。邻近标记技术的关键是所使用的具有连接活性的工具酶，从结构上来说其主要可分为完整型和拆分型两类，完整型的邻近标记酶主要用于研究单个目的蛋白的潜在互作蛋白，而拆分型的邻近标记酶则是用于研究与已知的蛋白复合体或互作蛋白存在关联的蛋白（图1）。《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

图1 邻近标记技术原理示意图(Yang et al., 2021)。（A）基于完整型邻近标记酶的邻近标记测定。将生物素连接酶或抗坏血酸过氧化物酶（APEX酶）与目标蛋白融合并在活细胞中表达，再向培养基中添加底物，例如生物素或生物素-苯酚和过氧化氢（H2O2）后，目标蛋白质附近的蛋白或RNA可以被生物素标记。通过裂解细胞并与亲和素磁珠一起孵育，可以富集被生物素标记的蛋白质或RNA，用于后续的LC-MS/MS或高通量测序分析。（B）用于识别蛋白质复合物组成的拆分型邻近标记酶系统。邻近标记酶的N端和C端部分分别与一对已知的互作蛋白融合。当这对蛋白在细胞中相互作用时，邻近标记酶的两半被拉得很近，并重组成完整的邻近标记酶，对蛋白质复合物附近的蛋白进行标记，通过裂解细胞并与亲和素磁珠一起孵育，可以富集被生物素标记的蛋白质，用于后续的LC-MS/MS测序分析。
常用的临近标记酶
用于蛋白质互作鉴定的邻近标记酶有很多，其中常用的两类工具酶是大肠杆菌生物素连接酶BirA的突变体（BioID）和抗坏血酸过氧化物酶（APEX）。基于BioID的邻近标记技术最先被研发出来，并首先应用在哺乳动物细胞中，用于表征蛋白的相互作用组(Roux et al., 2012)。BioID酶可以将邻近蛋白质的赖氨酸残基生物素化。该酶简单无毒，但催化效率较低，通常需要18-24小时的标记时间。此外，BioID的最适催化活性温度为37°C，该温度下植物会受到热胁迫，因此在一定程度上限制了其在植物体系中的广泛应用。

随后研发出来的APEX与ATP、H2O2以及生物素-苯酚一起供应时，APEX会在靶蛋白半径20nm的范围内生物素化邻近蛋白质，所有富含酪氨酸残基的相邻蛋白质都有可能在短短1分钟内被APEX生物素化(Rhee et al., 2013)。APEX虽然比BioID催化效率更高，但其发挥作用需要添加底物分子H2O2，但H2O2易对细胞产生毒性，引起细胞或组织的氧化应激。另外，与BioID一样，APEX催化温度也为37℃，这也限制了其在植物体系中的应用。

为了更好地在植物中应用邻近标记技术，斯坦福大学的Alice Ting课题组在2018年通过酵母表面展示技术对BirA进行定向进化，开发出了新的邻近标记酶TurboID（35kDa）及其截短突变体miniTurboID（28kDa）(Branon et al., 2018)。这两种新的邻近标记酶结合了BioID和APEX的优点，不仅催化效率高且不会对活细胞造成损害。除此之外，基于TurboID和miniTurboID的邻近标记还有一个显著的突破，就是可以在室温（25°C）下实现有效的生物素化，而不像BioID和APEX系统所需的温度为37°C。通过将TurboID与感兴趣的目的蛋白融合表达于细胞内，在ATP与生物素的参与下，可在活细胞中对约10nm范围内的邻近蛋白进行生物素标记，标记时间约10分钟左右。目前，基于TurboID的邻近标记技术已成功应用于植物体系。

除了上述邻近标记酶之外，近些年科学家们也陆续优化并开发出了许多其他的邻近标记酶，例如APEX系列的优化酶APEX2；BioID系列的优化酶BioID2、AirID、BASU等；以及一些小范围使用的工具酶如HRP、EXCELL、PUP-IT、NEDDylation，这些工具酶的开发使邻近标记技术的应用范围不断扩宽。

表1 目前用于蛋白质互作鉴定的邻近标记酶(Yang et al., 2021)。

《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

Plant Communications, 2 (2021) 100137. doi:10.1016/j.xplc.2020.100137

主要应用方向
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（1）蛋白互作网络研究
近年来，邻近标记技术已经越来越多地被应用于蛋白质相互作用网络的研究中。将邻近标记酶与多个诱饵蛋白融合表达，并结合质谱信息获得相应的邻近蛋白信息。通过整合来自多个诱饵蛋白的邻近蛋白质组，并计算重叠和交叉程度，可以确定核心蛋白的近端关系，并生成整体的邻近网络（图2）。例如，Gupta等人用58种诱饵蛋白绘制了中心体-纤毛界面的组成和空间组织，并生成了一个包含超过7000种相互作用的蛋白互作网络图(Gupta et al., 2015)。Anne-Claude Gingras的实验室通过使用139个诱饵蛋白系统地研究了mRNA相关颗粒和小体的组成，并生成了一个由1792种蛋白质组成的网络，其中包含了7424种独特的近端相互作用关系(Youn et al., 2018)。《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

图2 使用邻近标记技术识别单个蛋白互作，破译不同蛋白质的空间关系，构建蛋白质相互作用网络(Yang et al., 2021)。
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（2）细胞器蛋白组和膜接触研究
常规的蛋白组研究可以通过离心分离的方法收集不同的细胞器，例如细胞核、线粒体等，然后对其进行蛋白组的分析。但是，由于缺乏纯化这些细胞器特定区域的技术，因此，这些特定区域的蛋白质组成无法通过常规的蛋白组学技术获得。而利用邻近标记技术对细胞器不同区域的蛋白进行标记后，可以对这些蛋白进行进一步的精细分离，从而解析细胞器特定区域的蛋白组成。例如，Alice Ting课题组利用邻近标记技术对线粒体的不同亚细胞区域，包括线粒体基质、外膜以及内膜和外膜的膜间隙蛋白进行精细定位分析（图3A），从而鉴定出了许多新的线粒体蛋白，并重新定义了几种在先前研究中定位不明确或有争议的线粒体蛋白(Rhee et al., 2013; Hung et al., 2014; Hung et al., 2017)。另外，邻近标记技术在膜接触方面的研究也具有很大的优势。将拆分型的邻近标记酶分别与两个可能发生膜接触的细胞器进行融合，当这两个细胞器发生接触后，拆分型的邻近标记酶会重组成一个完整型的邻近标记酶，进而对周围可能介导膜接触的蛋白进行标记，结合质谱分析就可以获得在膜接触方面发挥重要作用的潜在蛋白（图3B）。使用该系统，科学家们目前已经鉴定出了许多与内质网-线粒体接触位点相关的新型蛋白质(Kwak et al., 2020)。

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图3 用完整型或拆分型的邻近标记酶对亚细胞器特定区域（A）和膜接触部位（B）进行蛋白质组学分析(Yang et al., 2021)。
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（3）蛋白质拓扑结构和表面基团
了解膜定位蛋白的拓扑结构对于深入研究它们在信号转导、分子运输和其他细胞过程中的功能作用至关重要。利用邻近标记技术将已知的跨膜蛋白与邻近标记酶进行融合后，就可以在整个膜水平上将与邻近标记酶处于同一侧的肽段进行标记，结合质谱分析可以确定膜蛋白的朝向，从而有助于进一步的研究（图4A）。迄今为止，科学家们已经使用基于APEX或Contact-ID的邻近标记系统对许多内质网或线粒体定位蛋白的膜拓扑结构进行了深入研究和重新定义(Kwak et al., 2020; Lee et al., 2017; Yoo and Rhee, 2020)。在蛋白质表面基团分析方面，由于蛋白质上的酪氨酸或赖氨酸的暴露水平通常与其被邻近标记酶标记的强度呈正相关，因此，分析肽段的生物素化强度可以深入了解蛋白质的动态结构（图4B）。《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

图4 利用邻近标记技术来确定蛋白质的拓扑结构和蛋白质的动态结构。由于线粒体内膜（IMM）对小分子的不通透性，邻近标记将仅发生在膜间隙IMS（红色）或基质侧（紫色）(Yang et al., 2021)。
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（4）蛋白-核酸互作
转录因子和特定基因组位点之间的相互作用对基因表达产生的调控对于活细胞的基因组稳定性至关重要。但是，由于传统技术的局限性，在活细胞中解析与特定基因组位点相关的蛋白质仍然具有挑战性。而通过将邻近标记技术与dCas9相结合可以有效的解决上述问题。dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但在相应的sgRNA的指导下仍能靶向特定的基因组位点(Qi et al., 2013)。因此，与dCas9的融合使邻近标记酶能够靶向特定基因组位点并随后标记邻近蛋白（图5A）。这些被标记的蛋白质可以通过LC-MS/MS进一步富集和分析，从而鉴定出与基因组位点相关的蛋白质(Gao et al., 2019)。RNA-蛋白质相互作用在基因表达的调节以及mRNA的加工、运输、翻译和稳定性中发挥着重要作用。然而，目前鉴定RNA相关蛋白的方法依赖于RNA-蛋白质复合物的纯化，并且需要体外操作。它们不能反映天然细胞环境中的RNA-蛋白质相互作用。而邻近标记技术的开发也为研究RNA相关蛋白提供了新的解决方案。例如，将邻近标记酶与dCas13融合来研究RNA-蛋白质的互作，dCas13在sgRNA的指导下能够特异性地靶向RNA的特定结构并将邻近标记酶引入该位点，从而使与靶RNA基序结合或靠近的蛋白质生物素化（图5B）(Han et al., 2020)。

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图5 通过将邻近标记与其他现有技术相结合，鉴定与特定基因组位点（A）或RNA基序（B）结合的蛋白质(Yang et al., 2021)。
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（5）亚细胞转录组分析
在真核细胞中，RNA通常被转移到特定的亚细胞区室进行局部翻译，这对许多生命过程至关重要(Buxbaum et al., 2015)。研究亚细胞RNA的常规方法包括荧光原位杂交（FISH）和免疫沉淀法结合微阵列或深度测序，但这些方法存在一定的局限性，例如，FISH实验复杂的生化操作是大多数实验室难以掌握的。而邻近标记技术的开发为研究亚细胞的转录组提供了一条新途径。例如，通过将邻近标记酶与特定的蛋白融合后固定在内质网上进而对周围的核糖体进行标记，然后富集生物素化的核糖体，并通过深度测序（即核糖体分析）即可对核糖体结合的RNA进行表征，确定处于翻译的RNA（图6）。另外，还可以利用邻近标记技术来研究逆境响应颗粒（Stress granules）中的非编码RNA组成，通过将邻近标记酶与颗粒中已经报道的蛋白融合，从而对周围的核酸进行标记。经过分离富集生物素化的核酸并结合高通量测序分析就可以获得相关的非编码RNA的信息（图6）。《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

图6 利用邻近标记技术绘制有膜或无膜细胞器的RNA组图。这些RNA既可以是用于翻译的mRNA，也可以是非编码RNA(Yang et al., 2021)。
文献举例
与在动物系统中的广泛应用相比，邻近标记技术在植物中的应用虽然起步较晚，但是目前也已经有许多的研究成果相继报道。小远今天就以一篇文献为例，简单为大家讲讲邻近标记技术在研究植物蛋白互作方面的应用，下面就让我们一起看看这项技术的魅力吧。植物NLR（Nucleotide-binding leucine-rich repeat, NLR）免疫受体类蛋白在介导植物对多种病原体的免疫反应中起着关键作用。但NLR蛋白的表达量低，再加上NLR调控网络的动态特性，使得常规方法难以捕获直接参与NLR信号通路的蛋白质。2019年7月19日，张永亮等人在Nature Communications杂志上发表了题为“TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity”的研究论文。该研究将邻近标记技术成功的应用于抗烟草花叶病毒（TMV）免疫受体蛋白N的互作蛋白研究中，并确定了一种新型调节因子UBR7，它可以直接与N NLR相互作用并在N蛋白介导的TMV抗性期间介导其周转。

作者利用在本氏烟中建立起的邻近标记体系（图7），对N蛋白介导的抗TMV免疫反应中可能与N蛋白发生互作的蛋白进行了分析。将TurboID融合在N蛋白的C端，同时设置Citrine融合的TurboID用作阴性对照（图8a）。在确定融合蛋白的功能及表达不受限制后，作者对存在/不存在TMV p50效应因子情况下与N蛋白相互作用的蛋白进行分析。为了量化邻近标记蛋白的相对丰度，作者制备并分析了没有p50的I组样品和有p50的II组样品（图8b），最终在I组和II组中分别鉴定了3198和3262种蛋白。

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图7 本氏烟中基于TurboID的邻近标记技术实验流程示意图(Zhang et al., 2019)

《你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？》

Nature Communications, doi:10.1038/s41467-019-11202-z

图8 N NLR免疫受体的邻近和相互作用蛋白的鉴定(Zhang et al., 2019)。（a）用于鉴定N的邻近和相互作用蛋白的载体示意图，载体中的HA标签用于鉴定融合蛋白的表达是否正常。（b）实验设计和标记条件图。（c）I组和II组的分层聚类显著富集了相互作用的蛋白质。（d）维恩图描绘了在不存在或存在p50的情况下与gN（左）或N-TIR（右）相互作用的蛋白质。（e）维恩图描绘了在p50不存在（左）或存在（右）的情况下，与gN和/或N-TIR相互作用的蛋白质。

通过对质谱获得的蛋白数据进一步分析，作者最终选择了其中的一种蛋白UBR7，该蛋白在N-末端规则蛋白酶解途径中发挥作用，其在酵母、动物和植物中高度保守。通过双分子荧光互补和GST pull-down实验也进一步证实了UBR7可以和N蛋白互作，并且互作的区域是N蛋白的TIR结构域（图9）。

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图9 分析N蛋白和Nb UBR7在体内和体外的相互作用(Zhang et al., 2019)。
小远叨叨
文章至此就告一段落了，今天主要是和大家聊一下邻近标记技术的原理以及应用，讲解的内容都比较偏基础，希望大家读完小远的文章可以对邻近标记技术有一定的了解，在今后的研究过程中大家如果研究的是蛋白之间的瞬时/弱相互作用，不妨换一条思路试着用邻近标记技术来研究，当然该方法的使用也需要注意一些事项，例如邻近标记酶的选择、设计合适的对照组、摸索合适的标记范围和标记时间等等，大家在使用之前也要多查阅一些资料哦！最后希望本期的文章能对大家的研究有所帮助~
References：Buxbaum A.R., Haimovich G., Singer R.H. In the right place at the right time: visualizing and understanding mRNA localization. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2015, 16: 95-109.

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官网链接：plant.biorun.com
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