酵母杂交那些事儿（二）

2022年6月21日 0条评论 749次阅读 0人点赞

在前几期的推文酵母杂交那些事儿（一）中小远给大家介绍了酵母单杂、双杂、三杂相关的实验原理，当时由于篇幅有限，有些内容还未讲完，所以，今天我们就接着上次没讲完的内容继续往后面讲，先跟大家剧透一下，今天的内容主要是拓展酵母双杂，大家肯定有疑问，上一次已经拓展的很多了，为啥还要拓展，小远猜想是因为酵母双杂是开启酵母杂交实验的开端，而每一种方法都存在其缺点与局限性，所以科学家们一直在探索如何改进，因此就诞生了很多关于酵母双杂的改良版本，下面就跟着伯小远一起去看看吧！

1.细胞质酵母双杂交系统
经典的酵母双杂（Y2H）系统对某些种类的蛋白质可能不太适用，例如转录因子(Fashena et al., 2000)。当转录因子与DNA结合结构域融合时，转录因子会自主激活转录，因此不能用Y2H实验进行研究。针对这个现象科学家们研发了对应的替代方法，如被抑制的反式激活因子（RTA）系统(Hirst et al., 2001)或基于RUra3的分裂泛素分析(Laser et al., 2000)。尽管这些系统能够绕过Y2H系统在自激活蛋白方面的局限性，但这些分析也不免有其独特的缺点，因此，这些方法并没有被大规模使用。所以小远在这篇文章中也就不介绍啦，大家有兴趣可以自己去查看文献哦！针对具有转录激活活性的蛋白，为了创建一个应用广泛且灵活的筛选系统，可以对已有的分裂泛素系统进行修改(Johnsson nils and Varshavsky alexander, 1994)。分裂泛素系统小远在上一篇文章中已经介绍过了，千万不要说不知道分裂泛素系统是什么系统哦，忘记的同学可以去酵母杂交那些事儿（一）中看膜体系酵母双杂，该系统就是分裂泛素系统，因为其原理是将一个完整的泛素分成两个，所以叫分裂泛素，哈哈，这个笑话是不是有点冷，但文献中就是这么解释的，不是小远胡说八道哦！好了，言归正传，分裂泛素系统是应用最广泛的蛋白质互作系统之一，已经成功地应用于蛋白质相互作用的鉴定，包括完整的膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白(Auerbach et al., 2002)。通过结合分裂泛素分析与使用多个独立报告基因的严格转录表达，建立了一个筛选系统，可以用于检测具有转录活性蛋白之间的相互作用，并通过cDNA文库筛选来识别一个感兴趣的蛋白的新的相互作用蛋白。这就是我们下面要介绍的细胞质Y2H（cytoY2H）系统。cytoY2H系统也是利用分裂泛素系统(Johnsson nils and Varshavsky alexander, 1994；Stagljar et al., 1998)。一个感兴趣的蛋白（诱饵）通过融合小的完整膜蛋白Ost4p(Kim et al., 2003)从而被锚定在膜（这个膜不是细胞膜，而是内质网膜，这个锚定蛋白就是整个细胞质酵母双杂的关键哦！）上，并融合到一个由泛素的C半端部分（Cub，即泛素分子被截断后的C端）和人工转录因子LexA-VP16组成的表达载体上（图1A）。通过将诱饵锚定在内质网膜上，可以通过阻止其向细胞核转移来筛选具有转录活性的蛋白质。

另一种蛋白融合到泛素N半端的突变体（NubG，即泛素分子被截断后的N端，并且将其中的第13位异亮氨酸突变为甘氨酸，故记为NubG）上，这种突变体对Cub缺乏内在的亲和力，从而可以避免发生自发重组。如果这两个蛋白相互作用，Cub和NubG被迫靠近并重新结合形成完整的泛素，然后被细胞泛素特异性蛋白酶（UBPs）识别。UBPs将融合在Cub上的多肽链裂解，从膜上释放LexA-VP16转录因子。然后，LexA-VP16移动到细胞核，在那里它可以激活整合在酵母报告菌株基因组中的LexA应答报告基因HIS3、ADE2和lacZ。蛋白质相互作用的检测是通过测量激活的报告基因的表达来实现的。因此，细胞质Y2H系统将发生在细胞核外的相互作用转化为一个确定的转录反应，导致在标准的β-半乳糖苷酶试验中，酵母菌落在选择培养基上生长或表现为蓝色菌落。

《酵母杂交那些事儿（二）》

图1 cytoY2H系统原理图(Möckli et al., 2007)。

cytoY2H系统可以应用于传统酵母双杂交系统中难以研究的蛋白质，包括转录因子，如p53和NF-κB复合体成员。利用cytoY2H系统进行cDNA文库筛选，鉴定了未鉴定的酵母蛋白Uri1p（Uri1p是一种细胞质非常规预折叠蛋白，其分子功能目前尚未明确。之前无法在传统的Y2H体系中使用Uri1p，很可能是因为它的酸性区域较大。）的几个新的互作伙伴(Möckli et al., 2007)。cytoY2H系统通过提供一种方便的方法来筛选转录活性蛋白，是对蛋白质相互作用的检测方法的一种拓展！

既然这里提到了分裂泛素系统，那小远就再啰嗦一下，给大家讲讲膜体系酵母双杂的一些注意事项，在酵母杂交那些事儿（一）中小远只是对膜体系酵母双杂的原理进行了介绍，要是真的进行应用，相对于经典的酵母双杂系统，其过程会相对麻烦一点，不仅仅是研究的蛋白定位在细胞膜上那么简单，想要具体了解就请继续往下看！

2.膜体系酵母双杂交的注意事项
与经典的酵母双杂系统的诱饵和猎物之间的相互作用发生在细胞核中不同，分裂泛素膜酵母双杂交系统（MbYTH）检测的是细胞膜上完整的膜蛋白之间的相互作用。Cub-TF和NubG必须位于细胞质中，才能使人工转录因子再结合以及裂解。因为不同种类的完整膜蛋白在其各自的N和C末端的胞内（或胞外）或胞质定位上是不同的，一个表达NubG与一个完整的膜蛋白融合的单一cDNA文库可能偶尔会将NubG部分定位在细胞膜的外侧，这取决于该蛋白在膜中的方向。例如，受体酪氨酸激酶（RTKs）是I型完整膜蛋白，其N端位于细胞膜外，C端位于细胞质内。因此，一个NubG融合到猎物N端部分的NubG-prey cDNA文库（NubG-x文库）将表达一个与NubG融合且位于胞外的蛋白，无法被诱饵的胞质Cub-TF部分结合。因此，在筛选NubG-prey cDNA文库时，我们可能无法发现诱饵和RTKs之间的相互作用。II型完整膜蛋白的N端在细胞质中，因此，在NubG-x cDNA文库中表达时可以正确显示胞质NubG。因此，要使用MbYTH系统筛选文库，要么首先知道目标蛋白的膜拓扑结构，以便构建合适的融合蛋白文库（NubG-x或x-NubG），要么必须同时筛选两种文库。在构建MbYTH系统的cDNA文库时需要考虑的一些特殊点：1、确保cDNA定向克隆到表达载体是非常重要的。如果不这样做，就会得到表达不对应于ORF序列的低复杂度文库；2、MbYTH系统的cDNA文库最好选择全长cDNA，以确保能够以原生方向插入膜的完整膜蛋白得到表达。在实践中，构建全长cDNA文库具有挑战性。随着方法的发展，人们希望cDNA文库将编码越来越多的全长蛋白质。
3.分裂色氨酸系统
受泛素拆分系统的启发，开发出了其他分裂蛋白传感器系统。前面提到的cytoY2H系统是基于间接的反应，需要激活信号通路或转录，而分裂蛋白传感器原则上可以直接反应它们的重建。2004年，Tafelmeyer等人提出了一种组合方法来生成分裂蛋白传感器。他们使用酵母色氨酸生物合成中的一种酶，N-（5-磷酸核糖基）-邻氨基苯甲酸异构酶（Trp1p），对不同组合的片段对进行活性选择。鉴定出了C端（CTrp）和N端（NTrp）片段，这些片段只有在融合到两个相互作用的蛋白质上时才能使CTrp和NTrp结构域接近，重建得到有活性的Trp1p。因此，相互作用的片段导致Trp1p重组，并允许trp1缺失的酵母菌株在缺乏色氨酸的培养基上生长。这个系统有几个优点。该反应是直接且与排列无关的，即与是否使用CTrp或NTrp构建诱饵载体无关。它普遍适用于所有类型的蛋白质，因为相互作用反应完全独立于细胞定位之外。下面特别介绍一下有活性的色氨酸对（即色氨酸的切割方式，在哪个位置切开得到的CTrp和NTrp是可以用于研究蛋白互作的片段）的筛选方法，这个方法比较独特，不信你可以往下看！《酵母杂交那些事儿（二）》图2 分裂色氨酸蛋白生成的组合方法(Tafelmeyer et al., 2004) 。作为一个起点，使用一个TRP1基因的重排拷贝（灰色），在这个拷贝中，原始的TRP1的N端和C端由一个包含唯一AvrII位点的短连接子连接起来。（1）将线性片段与T4 DNA连接酶孵育，使基因成环，同时形成二聚体和高级寡聚体。（2）用DNaseI处理连接混合物，随机切割出线性分子，并分离出与TRP1大小相对应的片段。（3）分离的片段被克隆到一个酵母表达载体中，该载体包含两个多肽，它们结合成一个反向平行的螺旋状结构（绿色[C1]和黄色[C2]盒子）。需要注意的是，由于平末端克隆步骤，大多数克隆将携带TRP1片段，这些片段含有一个或两个形成螺旋的多肽，或以错误的方向插入质粒。（4）利用酵母细胞中的同源重组将一个终止子序列和PGAL1启动子（浅灰色框）插入Trp1p的原始N端和C端之间。（5）通过对这两个片段的共表达和对酵母细胞色氨酸缺陷互补的选择，分离出功能性的色氨酸分裂对。

《酵母杂交那些事儿（二）》

图3 酵母中可补充色氨酸缺陷的选择性分裂色氨酸蛋白对(Tafelmeyer et al., 2004) 。克隆以每个N端片段的最后一个残基命名。灰色矩形代表Trp1p对应的N端和C端片段。C1和C2是形成反平行螺旋[22]的两个多肽。由于阅读框的移位，11个克隆中有6个克隆的C2被10个或66个氨基酸的多肽取代。11个分离克隆中有6个具有重叠的TRP1序列。这就要求它们是由TRP1寡聚基因的2倍酶解产生的。

说明：图2图3介绍的是寻找有功能的色氨酸分裂对的方法，小远是第一次遇见这样的方法，虽然这个文献发表出来也有很多年了，但要不是这次写文章，可能也不会看见，不知道大家之前有没有遇到过呢！为了帮助大家理解，这里的C1和C2是可以互作的两个多肽，加了这个前提大家理解起来是不是就更容易啦。通过这种方式筛选出可用的色氨酸对之后，如图3所示，然后在细实线处切开，分成两段，即CTrp和NTrp，然后将C1和C2分别替换成我们要研究的目的蛋白，也就是分别将需要研究的两个蛋白构建至色氨酸的N端以及C端，然后共转酵母，在对应的培养基上进行筛选，如果可以在缺乏色氨酸的培养基上生长，那就证明两个蛋白存在互作！

上面介绍的两种方法都是经典酵母双杂系统的改进版，其实关于酵母双杂还有一些其它的方法，遇到的概率一般不是很大，所以，这里就不在做过多的介绍了，大家有兴趣可以自己去搜集文献查看哦！或者以后遇到了，小远觉得有必要也会再给大家讲的！

针对经典酵母双杂的局限性，科学家们探索出了不同的方法进行解决，那么针对工作量巨大的经典酵母双杂筛库，科学家们又做了哪些改进呢？

4.Y2H-seq
酵母双杂交分析是目前应用最广泛的验证两个蛋白相互作用的方法之一。酵母双杂数据集对蛋白质相互作用存储库(Stark et al., 2006)和概率相互作用组数据库做出了重大贡献(Szklarczyk et al., 2015；Lee et al., 2015)。然而，大规模的酵母双杂数据采集仍然受到跟踪交互作用和生成完整交互体图所需的迭代筛选的成本和劳动力需求的限制(Venkatesan et al., 2009)。利用高通量测序来识别相互作用的进展使得大规模的酵母双杂筛查变得更加可行(Yu et al., 2011；Weimann et al., 2013；Yachie et al., 2016)。Y2H-seq就是酵母双杂结合高通量测序的一种方法！Y2H-seq与传统Y2H的原理相同。将诱饵蛋白融合到Gal4 DNA结合域（Gal4BD），并筛选与含有融合到Gal4激活域（Gal4AD）的假定的猎物蛋白的cDNA文库的相互作用。在相互作用时，Gal4被重组成一个功能性转录因子并驱动选择性标记的表达，最典型的是HIS3缺陷营养标记，它允许在缺乏组氨酸的培养基上生长。在常规筛选中，每个菌落被分离并通过Sanger测序单独分析。因此，这种技术是耗时且费力的。而Y2H-seq是将所有能够在选择性培养基上生长的菌落聚集在一起，提取它们的质粒DNA，通过对单个样本进行高通量测序来识别编码单个诱饵的所有相互作用基因。除了允许识别更多候选互作蛋白的相互作用外，Y2H-seq还可以提供基于读取频率互作蛋白的定量排名。《酵母杂交那些事儿（二）》

图4 Y2H-seq流程图(Erffelinck et al., 2018)。

5.CrY2H-seq
为了避免单独筛选诱饵蛋白以追踪相互作用，科学家开发了多种筛选策略，使诱饵文库与猎物文库进行筛选(Yachie et al., 2016；Hastie Alex R and Pruitt Steven C, 2007)。条形码融合遗传学（BFG-Y2H）利用细胞内DNA重组的条形码开放阅读框（ORF）克隆识别相互作用的蛋白，从而使酵母双杂阳性菌落可以同时被汇集和测序。然而，在进行条形码ORF关联筛选之前，由于每个条形码诱饵和猎物克隆的分离和测序要求，这种技术在进行大规模筛选时很快变得昂贵。为了更有效地进行迭代筛选，科学家开发了Cre-报告基因介导的酵母双杂交结合高通量测序（CrY2H-seq）。CrY2H-seq使用Cre重组酶作为酵母双杂蛋白—蛋白相互作用的报告基因，在细胞内通过蛋白编码序列侧翼的特殊loxP位点共价和单向连接相互作用的诱饵和猎物质粒。连接的蛋白质编码序列可作为相互作用的识别DNA分子，使大规模的多重筛选结合高通量DNA测序来检测蛋白质之间的相互作用。《酵母杂交那些事儿（二）》图5 CrY2H-seq菌株及质粒设计。（a）CrY2H-seq使用酵母株CRY8930和Y8800。（b）CrY2H-seq诱饵和猎物质粒pDBlox和pADlox在ORF插入的3’端侧翼含有lox突变位点（分别为lox66和lox71）。在质粒Cre/lox-重组后，使用DNA激活结构域（AD）和DNA结合结构域（BD）特异性引物，通过PCR扩增可恢复融合ORF产物，如图灰色箭头所示。（c）AD和DB引物的代表性PCR扩增子显示融合的ORF。突变的lox位点有下划线标记。

《酵母杂交那些事儿（二）》

图6 CrY2H-seq筛选过程。第一天，将诱饵文库与猎物文库进行一个大规模地多倍体交配培养，并过夜进行二倍体选择。第2天，将二倍体培养物接种在培养基上，以选择具有蛋白相互作用介导的Gal4重组和随后的HIS3和CRE报告基因转录激活的细胞。HIS3的表达允许细胞在选择培养基上存活，CRE的表达允许单向质粒连接，与蛋白质相互作用相对应的ORF组合在细胞内固定在一起。经过3d的选择后，大量收集存活的细胞，并且在单一制备中纯化质粒，并在多模板PCR反应中扩增Cre-重组的ORF连接。从这些扩增子中，我们准备了一个Illumina测序文库并进行了测序。利用生物信息学识别来自Cre重组PCR产物的片段。

小远叨叨
小远没想到居然需要花一个文章的篇幅来给大家介绍经典酵母双杂交系统的改进版本，并且还没有全部介绍完，本文只是挑取了其中一些相对常见的内容介绍给大家，可想而知，要是把所有的内容都介绍完得用多少字才行！通过上面的介绍，我们可以发现当发明了一种实验方法之后，并不意味着就可以一劳永逸了，针对现有方法的不足，科学家们进行了不断的探索与尝试，然后推出新的方法，这就是科研人应该具备的精神，不断尝试，不断创新，这样才能不断揭秘新的领域，推动科研的进步！好了，通过两篇文章的介绍，小远将酵母杂交相关的原理想介绍的基本都介绍完了，后面小远就要给大家上文献举例了，一起期待吧！参考文献：Auerbach D, Thaminy S, Hottiger M O, et al. The post‐genomic era of interactive proteomics: Facts and perspectives[J]. Proteomics, 2002, 2(6): 611-623.Erffelinck M L, Ribeiro B, Perassolo M, et al. A user-friendly platform for yeast two-hybrid library screening using next generation sequencing[J]. PLoS One, 2018, 13(12): e0201270.

Fashena S J, Serebriiskii I, Golemis E A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits[J]. Gene, 2000, 250(1-2): 1-14.

Hastie A R, Pruitt S C. Yeast two-hybrid interaction partner screening through in vivo Cre-mediated Binary Interaction Tag generation[J]. Nucleic acids research, 2007, 35(21): e141-e141.

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Lee T, Yang S, Kim E, et al. AraNet v2: an improved database of co-functional gene networks for the study of Arabidopsis thaliana and 27 other nonmodel plant species[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(D1): D996-D1002.

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Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, et al. STRING v10: protein–protein interaction networks, integrated over the tree of life[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(D1): D447-D452.

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Yachie N, Petsalaki E, Mellor J C, et al. Pooled‐matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics[J]. Molecular systems biology, 2016, 12(4): 863.

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《酵母杂交那些事儿（二）》

官网链接：plant.biorun.com

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